结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测和核酸检测对涂阴肺结核病早期诊断的价值

范大鹏，张艳，陈园园，鲍志坚

（杭州市红十字会医院，浙江 杭州 310003）

根据第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，我国涂阴肺结核人群是涂阳肺结核人群的5.9倍[1]。但是由于缺乏病原学依据，涂阴肺结核的诊断比较困难。分子诊断技术可将肺结核病原学诊断技术分为传统细菌学检验技术和依赖于核酸扩增技术的结核分枝杆菌快速检测技术，其中结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测技术（SAT-TB）和结核/非结核核酸检测（基于结核分枝杆菌DNA检测技术）就是其中具有代表性的分子检测技术。本研究收集涂阴疑似肺结核患者的肺泡灌洗液进行960快速培养，并采用SAT-TB和结核/非结核核酸检测技术，评价两种分子诊断技术对涂阴肺结核早期快速诊断的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年10月-2018年3月本院疑似肺结核的患者726例。入选标准：（1）胸片显示肺部阴影，临床疑似肺结核。（2）痰涂片抗酸染色连续3次阴性。排除标准：（1）经支气管镜检查灌洗液标本抗酸染色涂片为阳性。（2）临床进行支气管镜检查且无阳性发现者。根据肺结核诊断标准[2]，将726例分为涂阴肺结核组603例和非肺结核组123例。非肺结核组为无肺结核病病原学和病理诊断依据，无活动性肺结核的临床表现，经过其他非抗结核治疗后肺部病灶好转者，男76例，女47例，年龄（45.9±17.1）岁。603例涂阴肺结核患者按照“经灌洗液快速培养结核分枝杆菌是否为阳性”进一步分为灌洗液阳性组271例，其中男160例，女111例，年龄（43.9±19.4）岁；灌洗液阴性组 307 例，即灌洗液快速培养结核分枝杆菌培养阴性，但影像学与活动性肺结核相符，具有咳嗽、咯痰、午后低热、盗汗等临床肺结核症状，且经过诊断性抗结核治疗后肺部病灶吸收好转，其中男187例，女120例，年龄（45.3±18.7）岁；其余25例根据非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识[3]，纳为肺分枝杆菌病组，其中男 11 例，女 14 例，年龄（45.5±19.5）岁。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 TGL-16G高速离心机，快速分枝杆菌培养试剂盒（960），LightCycler480荧光定量PCR，SLAN-96S荧光定量PCR，960结核分枝杆菌快速培养试剂盒（美国BD公司，批号：705201），SAT-TB检测试剂盒 （上海仁度生物技术有限公司，批号：20171201），分枝杆菌核酸检测试剂盒（博奥生物有限公司，批号：20171109）。

1.2.2 检测方法 收集患者肺泡灌洗液10～15mL，混匀后均分3份分别进行960快速培养并行SATTB和结核/非结核核酸检测。（1）960结核分枝杆菌快速培养。无菌吸管吸取3～5mL肺泡灌洗液标本放入50mL离心管，后加入等体积NALC-NaOH混合后震荡并开始计时15分钟。打开管盖加PBS（pH=6.8）50mL，充分混匀放离心机中以相对离心力为3000×g离心。弃上清液，用无菌吸管加入1～2mL PBS（pH=6.8）混匀。取出0.5mL该混匀液加入有0.8mL生长添加剂/抑菌剂专用的960液体培养管中，扫描培养管上条形码放入孵育箱中进行培养。仪器报阳后进行抗酸染色，确认后报阳性生长时间，阴性结果42天后机器自行报告。（2）结核分枝杆菌RNA恒温扩增（SAT-TB检测）。肺泡灌洗液标本中加入4%NaOH进行消化 （剂量少于标本量的1.5倍）。根据SAT-TB试剂盒说明书操作。（3）结核/非结核核酸检测。根据检测试剂盒说明书对肺泡灌洗液进行操作，Ct值＜40为阳性，结果解读详见表1。

表1 结核和非结核核酸检测结果解读

1.2.3 960快速培养阳性菌株菌种鉴定 （抗原法）取960快速培养阳性物100μL加入结核分枝杆菌抗原MPB64检测板的加样孔中，15分钟后判读结果。结果判读C（质控区）和T（检测区）均出现红色线为结核分枝杆菌阳性，仅C出现红色线为结核分枝杆菌阴性，C未出现红色线表示反应板失效，需重新试验。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0软件进行统计学分析，以临床诊断[2]为标准计算三种方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和尤登指数。

2 结果

2.1 检测速度 960快速培养法对灌洗液标本的检测时间为（32.3±4.4）天，SAT-TB 和结核/非结核核酸检测时间为0.5天。两种分子诊断技术检测肺泡灌洗液标本时间较传统960快速培养法明显缩短。

2.2 诊断效能 以最终的临床诊断为金标准，结核/非结核检测的诊断效能最高，尤登指数为0.52，其次为SAT-TB，尤登指数为0.51，最后为960快速培养，尤登指数为0.47。详见表2。

表2 三种检测方法的诊断效能

3 讨论

SAT-TB是以其特异的16SrRNA为靶标，通过42℃恒温扩增对靶标进行RNA扩增产生荧光信号，并对荧光信号进行实时检测并判断标本中是否存在活菌的一种检测结核分枝杆菌的方法。以临床诊断为最终诊断标准，本文结果提示，在涂阴肺结核SAT-TB检测肺泡灌洗液的总检出率为50.8%，略高于范琳等[4]对涂阴肺结核患者灌洗液进行SAT-TB检测的检出率40%；SAT-TB诊断的敏感度为50.8%、特异度为99.2%，与文献报道[5-7]的敏感度81.0%～97.8%、特异度84.2%～100%基本一致。但观察中发现，SAT-TB技术存在一定的漏检率，临床诊断中如遇到SAT-TB检测阴性，要结合患者的其他指标作出最终诊断。

结核/非结核核酸检测结核分枝杆菌技术是针对核酸上的靶序列进行扩增，通过2个通道进行结核分枝杆菌和分枝杆菌的检测。该技术不会区分活菌和死菌。本文中肺分枝杆菌病组中结核/非结核核酸检测NTM-DNA全部阳性，而960快速培养检测阳性率只有46.8%，结核/非结核核酸检测阳性率为52.4%，也说明了该技术会检测出一部分死菌。本文中肺分枝杆菌病组中结核/非结核核酸检测NTM-DNA全部阳性，可见该技术在早期防止分枝杆菌误诊为肺结核病有一定优势。但本研究入选分枝杆菌病患者太少，有些问题尚不能充分暴露，还要扩大样本继续研究。

在检测时间上，SAT-TB和结核/非结核核酸检测仅需0.5天，传统结核菌病原学诊断时间需1个月左右，SAT-TB在时效上有很大的优势。两种分子检测技术检出效能也都略高于960快速培养，在检测诊断的时效性上较有优势。

两种分子检测技术和960快速培养仍有一定检测结果差异，特别是在临床诊断为涂阴肺结核组中差异更大。究其原因，可能与该组基本临床症状均不明显、病情较稳定、体内细菌数较少有关。虽然SATTB检测的敏感度高，但是RNA极易降解，如果实验时操作处理不当就会造成漏检。SAT-TB敏感度在临床确诊为涂阴肺结核病组的敏感度略高于结核/非结核核酸检测，但在临床诊断为涂阳肺结核组中低，说明SAT-TB检测技术可以检测活菌和死菌。

分子检测技术操作时需注意污染问题。本文在非肺结核患者中两种分子检测都有1例假阳性检出，可能与在SAT-TB检测时标本被污染有关，而结核/非结核核酸检测可能是由于支气管镜消毒杀菌后清洗不干净而残留DNA引起。

综上所述，两种分子检测技术均具有960快速培养的检测能力，对涂阴肺结核病提供病原学依据对肺结核病的早期确诊有很大帮助。