湖北黄石典型水域超微型真核浮游生物多样性研究

于佳骏, 段钰涵, 刘科赛, 刘细霞, 侯建军, 李运涛



湖北黄石典型水域超微型真核浮游生物多样性研究

于佳骏, 段钰涵, 刘科赛, 刘细霞, 侯建军, 李运涛*

湖北师范大学, 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室, 黄石 435002

为探讨湖北省黄石市典型水域中超微型真核浮游生物多样性, 采用18S rDNA 扩增片段限制性酶切技术, 结合优势类群测序及相关统计学分析, 对2015年夏季湖北黄石境内营养程度不同的典型水域(长江, 磁湖, 青山湖, 青港湖)中超微型真核浮游生物的群落组成及遗传多样性进行了研究。结果表明, 4个水域的超微型真核浮游生物多样性有明显差异, 多样性随水域营养化程度的增高而降低。优势克隆的测序结果显示, 优势类群藻类包括隐藻、绿藻、甲藻, 真菌包括隐真菌和壶菌, 此外还有纤毛虫及未分类的浮游生物, 隐藻在4个水域中都占优势。不同水域的优势类群差别较大。优势类群的种类随水域营养化程度的增加而减少。群落的多样性与总磷呈极显著的负相关。

超微型真核浮游生物; 生物多样性; ARDRA技术; 淡水水域

0 前言

超微型浮游生物是指粒径小于或等于5 μm的浮游生物[1], 它们作为生态系统中不可缺少的重要环节[2-3], 具有生长快、数量多、周转速率高的特点, 虽然个体微小, 但仍然可维持相当高的生产力[4–5]; 它们还可以通过被捕食而进入经典食物网[6]。超微型浮游生物可以作为水体营养状态的判断依据[7]。

随着经济社会的发展, 城市人口急剧增长, 生活生产过程中产生的各种污染物, 超过了城市自然环境的自净能力, 引起城市水域污染。城市水域的水质恶化会直接影响水中的浮游生物的种类和多样性。关于这方面的研究已有不少报道。梁迪文等对广州市不同类型水体轮虫群落结构进行了研究, 结果表明不同类型水体之间群落差异显著[8]。龚珞军等测定了武汉市5个养殖湖泊的浮游生物的数量和生物量, 根据浮游生物的种类和数量, 5个湖泊可以划分为不同的类群, 形成这个结果是由城市废水、生活污水和养殖生产所致[9]。目前, 关于城市不同类型水域中超微型真核浮游生物的研究比较少, 而这些研究有助于了解水体污染情况。

黄石市位于长江中游南部, 长江流经市区, 市区有磁湖等较大的湖泊。由于沿岸工矿企业较多, 污染问题比较突出, 但不同水域的污染程度不尽相同。关于黄石市辖水体中超微型真核浮游生物群落结构的研究尚缺乏, 故湖北黄石附近水域可以作为研究城市不同类型水域中超微型真核浮游生物的一个样本。本研究拟对黄石市典型水域(长江, 磁湖, 青山湖, 青港湖)中的超微型真核浮游生物的多样性进行初步调查, 分析水质与超微型浮游生物多样性的关系, 以探究污染程度不同的城市水域中的超微型真核浮游生物优势类群及多样性有何差异。研究结果可加深对淡水水域浮游生物多样性的理解, 并为城市水域水质污染评价和可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

结合前期对黄石水域的调研, 选取黄石境内4个营养程度不同的水域(长江、青山湖、青港湖、磁湖)作为研究站点(图1)。采样于2015年8月进行, 采集0.5 m内表层水样。每个研究站点各设置3个站点, 每个站点采集500 mL水样, 3个站点的水样混合后, 用200 μm筛绢进行初步过滤。滤液用5 μm的Isopore(Millipore)聚碳酸酯滤膜进行二次过滤, 二次过滤后的滤液再用GF/F膜(Whatman, 0.7 μm)进行过滤。吸干水分的GF/F滤膜置入-70 ℃超低温冰箱保存。

图1 采样站点分布图 (A: 磁湖; B: 长江; C: 青山湖; D: 青港湖)

Figure 1 The location of sampling sites (A: Cihu lake; B: Changjiang river; C: Qingshan lake; D: Qinggang lake)

现场用温度计测量水温, 其余项目采集后24 h内在实验室监测, 总氮、总磷、氨氮、化学需氧量(COD, 高锰酸钾指数)按《水和废水监测分析方法》(第4版)进行分析。pH值的测量采用上海雷磁PHSJ-4F型pH计进行。水中悬浮物的测定采用重量法, 参照《水质悬浮物的测定》(GB11901-1989)进行。

1.2 基因组DNA提取

保存的膜样品剪碎放于离心管中, 每管加入700 μL预热裂解缓冲液(1.0 mol·L-1NaCl; 50 mmol·L-1EDTA; 50 mmol·L-1Tris; 1% PVP), 混匀后65 ℃恒温水浴30 min, 水浴结束后12000 g离心5 min, 取上清液, 加入1/5倍体积的5×CTAB, 65 ℃水浴10 min,接着加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1), 12000 g 4 ℃离心10 min, 取上清液, 加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1), 12000 g 4 ℃离心10 min, 取上清液, 加入1/10体积3 M醋酸钠, 混匀, 加2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇, 于-20 ℃放置1 h, 12000 g离心10 min, 去除上清液, 加入1 mL 70%乙醇, 12000 g离心5 min, 去上清液, 干燥, 加入30 μL的无菌水, –20 ℃保存。

1.3 18S rDNA文库的建立

以提取的样品基因组DNA为模板, 扩增18S rDNA使用真核生物通用引物Euk328f(5`-ACCTG GTTGATCCTGCCAG-3`)和Euk329r (5`-TGATCC TTYGCAGGTTCAC-3)[10], 扩增片断长度约为1.8 kb。PCR反应条件为:(94 ℃, 60 s; 55 ℃, 60 s; 72 ℃, 90 s)×20, 每循环退火温度降0.5 ℃; (94 ℃, 60 s; 55 ℃, 60 s; 72 ℃, 90 s)×10; 72 ℃, 10 min。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

采用DNA凝胶纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)纯化扩增后的18S rDNA片断, 将纯化后的DNA片断与pGEM-T Easy Vector载体(北京普洛麦格生物技术有限公司)连接, 连接产物的克隆按通用分子生物学方法进行。随机选取一定数量的白色克隆子, 采用菌体直接扩增方式, 用Euk328f/Euk329r引物检测阳性克隆子。

1.4 ARDRA分析

以限制性内切酶HaeIII(上海赛默飞世尔科技有限公司)消化从各个阳性克隆子扩增出的18S rDNA片断。酶切反应结果用凝胶成像仪观察, 电泳图谱照片用Image lab 5.0软件分析。

1.5 数据分析

采用综合营养状态指数(trophic level index,)法来评价各水域的富营养化程度。选取总氮浓度()、总磷浓度()、高锰酸盐指数(COD)这3个指标作为参数用于计算综合营养状态指数, 具体计算方法参考王鹤扬的方法[11]。采用0—100的一系列连续数字对营养状态进行分级,()<30贫营养; 30≤()≤50中营养;()>50富营养; 50<()≤60轻度富营养; 60<()≤70中度富营养;()>70重度富营养。

将酶切结果中数目和大小均相同的片段归为同一个操作分类单位(Operational taxonomic unit,)。分别计算每个文库的覆盖率()、多样性指数()、均匀度指数以及优势度指数。优势度指数()计算公式为:=(/)[12], 式中为克隆文库中某种数量,为克隆文库中所有类型数,为某种在各站点中出现的频率, 当>0.02时, 该即为优势。文库覆盖率计算公式为[13]:=[l-(/)]×100%, 其中为克隆文库中只出现一次的类型数,为克隆文库大小。指数及均匀度指数的计算使用R 3.3(vegan包)。使用R 3.3软件(vegan包), 非加权组平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)以及Bray- Curtis距离对4个样本进行聚类分析; 使用Canoco 5软件, Bray-Curtis距离进行非度量多维尺度分析(Nonmetric multidimensional scaling, NMDS)。相关性分析采用SPSS 24软件, 使用 Pearson相关系数进行分析。

2 结果与分析

2.1 多样性分析

总共对4个文库中的362个克隆进行了酶切分析(表1)。酶切的结果一共可以划分为106个。4个水域共有的只有1个, 特有数目最多的水域是长江, 最少的是青港湖(图2)。不同水域之间存在着同一, 但同一在不同水域中分布却不同。其中只有一个克隆子的有46个, 有两个及两个以上克隆子的有60个。

分别计算了4个文库的覆盖率,多样性指数和均匀度指数(表1, 表2)。四个站点中只有长江的覆盖率低于70%, 说明总体的文库覆盖率还比较大; 青港湖的覆盖率最大, 但是丰富度却最小, 说明青港湖夏季的物种比较单一, 而其他的三个站点丰富度均达到了8以上, 表明这些站点夏季物种较丰富。

4个站点中, 磁湖的多样性指数和均匀度指数最高, 长江的次之, 青港湖的最低。多样性指数表明夏季磁湖的多样性和均匀度最高, 青港湖的最低。

聚类分析结果显示(图3), 长江和磁湖聚为1个小的类群, 表明两者的群落结构相似度最高, 其次是青山湖, 它与长江和磁湖聚为1个稍大的类, 青港湖的群落则自成一类, 表明青港湖的群落结构与其他3个站点的差别较大。NMDS分析得到了和聚类分析类似的结果(图3)。4个站点中, 长江站点和磁湖站点的超微型真核浮游生物群落结构相似度最高, 青山湖与青港湖的群落结构相似度较小。

图2 韦恩图展示四个水域特有和共有的OTU数目

Figure 2 Venn chart showing the number of unique and co-existingin four waters

表1 4个水域的扩增性rDNA限制性酶切片段分析

表2 4个水域的超微型真核浮游生物多样性指数

2.2 优势类群分析

测序的克隆子共有33个。优势的测序结果显示, 目标水域夏季超微型真核浮游生物的优势类群藻类包括隐藻、绿藻、甲藻, 真菌包括隐真菌和壶菌, 此外还有纤毛虫及未分类的浮游生物。隐藻中绝大部分都属于隐藻属, 绿藻则分别属于团藻目和小球藻目。

4个水域的浮游生物优势类群构成情况有明显的差异, 其中磁湖的优势群落构成最具多样性, 青港湖的最为单一(图4)。隐藻在4个水域中都占优势, 其中在青港湖中处于绝对优势(占72%)。绿藻、甲藻以及壶菌只在磁湖中处于优势, 隐真菌只在青山湖中处于优势, 此外每个水域中都存在很多未分类的浮游生物。

图3 4个水域群落结构聚类分析(左)和NMDS分析(右)

Figure 3 Cluster (left) and non-metric multidimensional scaling analysis (right) of sample community structure

图4 4个水域的群落结构组成

Figure 4 Community structure diagram of the four waters

2.3 多样性与理化因子的关系

多数理化因子在4个水域中有明显波动(表3), 青山湖和青港湖中的化学需氧量、氨氮、总氮和总磷指标要比磁湖和长江中的高。悬浮物在活水长江中比静水湖泊中的要大。综合营养状态指数显示, 长江和磁湖处于中营养状态, 而青山湖和青港湖处于富营养状态, 其中青港湖处于重度富营养状态。

理化因子与指数的相关性检验结果表明总磷、氨氮、总氮、化学需氧量和悬浮物都与指数呈负相关, pH和水温与指数呈正相关, 其中总磷与多样性指数呈极显著负相关(<0.01), 而其他理化因子的显著系数均大于0.05, 相关性不显著(表4)。多样性指数与综合营养状态指数呈负相关, 相关系数为0.054(表4)。

3 讨论

随着经济的发展, 工业、农业和生活的废水废物排入水中的排量日益增加, 引起水域污染以及富营养化, 水域的富营养化又会影响浮游生物的多样性[14–15]。由于超微型真核浮游生物处于食物链的底层[16], 其多样性变化会影响整个浮游生物的群落结构。有些研究表明, 中营养型湖泊中常以甲藻、隐藻、硅藻类占优势; 富营养型湖泊则常以绿藻、蓝藻占优势[17–21]。我们的结果显示, 在重度富营养的水体中(青港湖), 隐藻的比例达到了72%, 处于绝对优势, 绿藻不是优势类群。关于水域的优势类群, 我们的结果与别的学者的研究结果不尽相同。造成这种差异的原因可能是: (1)研究所针对的浮游生物粒径不同。不同粒径的浮游生物代谢活性及环境适应性不同, 这会导致在相同的环境中不同粒径的浮游生物生长情况不同。已有研究表明, 同一水域不同粒径的浮游生物其优势类群是不同的[22]。(2)水体环境因素的不同。浮游生物的生长受环境因素的影响, 环境因素的差异会导致优势类群的差异[23]。

本文所研究的4个水域多样性整体上随营养化程度的升高而降低(表4)。磁湖多样性指数最高, 但指数高于长江。分析原因, 可能是长江总磷高于磁湖, 总磷与多样性指数呈极显著负相关, 在所有测定的理化因子中对多样性的影响最大。故长江水域虽然指数低于磁湖, 但长江中较高的总磷影响了浮游生物的多样性, 使其多样性指数低于磁湖。这些结果提示不仅水体总的污染水平会影响浮游生物的多样性, 水体中污染物的类型也会影响多样性。4个水域的优势类群也呈现差异。磁湖的优势类群包括浮游植物、浮游动物以及真菌, 而青港湖的优势类群只有隐藻, 并且隐藻占绝对优势(比例大于70%)。这些结果显示, 水域富营养化会降低超微型真核浮游生物的多样性和均匀度, 富营养化程度越高, 多样性越低, 同时优势类群也越单一。

表3 4个水域的理化因子

表4 理化因子与Shannon-wiener指数的相关关系

[1] MASSANA R. Eukaryotic picoplankton in surface oceans[J]. Annual Review of Microbiology, 2011, 65(1): 91–110.

[2] 乐凤凤, 蔡昱明, 孙军, 等. 2009年冬、夏季南海北部超微型浮游生物的分布特征及其环境相关分析[J]. 海洋学报, 2015, 37(12): 41–55.

[3] PALFFY K, FELFOLDI T, MENTES A, et al. Unique picoeukaryotic algal community under multiple environmental stress conditions in a shallow, alkaline pan[J]. Extremophiles: life under extreme conditions, 2014, 18(1): 111–119.

[4] CARRICK H J, SCHELSKE C L. Have we overlooked the importance of small phytoplankton in productive waters[J]. Limnol Oceanogr, 1997, 42(7): 1613–1621.

[5] RICARDO S, RUBEN N, VIVIAN L. Summer succession of ultraphytoplankton at the EPEA coastal station (Northern Argentina)[J]. Journal of Plankton Research, 2009, 31(4): 447–458.

[6] 杨宇峰, 王庆, 聂湘平, 等. 海水养殖发展与渔业环境管理研究进展[J]. 暨南大学学报(自然科学与医学版), 2012, 33(5): 531–541.

[7] LEFRANC M, THENOT A, LEPERE C, et al. Genetic diversity of small eukaryotes in lakes differing by their trophic status[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(10): 5935–5942.

[8] 梁迪文, 王庆, 魏南, 等. 广州市不同类型水体轮虫群落结构的时空变动及与理化因子间的关系[J]. 湖泊科学, 2017, 29(6): 1433–1443.

[9] 龚珞军, 张仕萍, 熊邦喜, 等. 不同类型湖泊夏季浮游生物多元聚类分析[J]. 水生生物学报, 2010, 34(1): 43–50.

[10] GUILLOU L, VAULOT D, CLAUSTRE H, et al. Abundance and diversity of prymnesiophytes in the picoplankton community from the equatorial Pacific Ocean inferred from 18S rDNA sequences[J]. Limnol Oceanogr, 2000, 45(1): 98–109.

[11] 王鹤扬. 综合营养状态指数法在陶然亭湖富营养化评价中的应用[J]. 环境科学与管理, 2012, 37(9): 188–194.

[12] 刘奕伶, 葛继稳, 李艳元, 等. 古夫河着生藻类优势种体积与水质因子的相关性研究[J]. 中国环境科学, 2015, 35(7): 2182–2191.

[13] 黄小茉, 陶宏兵, 邱晓颖, 等. 基于16S rRNA基因文库技术分析水性涂料菌群的多样性[J]. 生物技术进展, 2016, 6(4): 295–298.

[14] 张建春, 蔡云富. 基于生态服务功能的黄石城区湖泊群引水调度研究[J]. 水利建设与管理, 2015, 35(9): 4–7.

[15] 钟诗群, 陈荣坤, 周杰, 等. 大通湖浮游植物群落结构与富营养化动态研究[J]. 生态科学, 2014, 33(3): 586–593.

[16] DANG Hongyue, LI Tiegang, CHEN Mingna, et al. Cross-ocean distribution of rhodobacterales bacteria as primary surface colonizers in temperate coastal marine waters[J]. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(1): 52–60.

[17] 邓春凯. 生物的指示作用与水环境[J]. 环境保护科学, 2007, 33(4): 114–117.

[18] 陆建芳. 山仔水库浮游植物群落特征及水体富营养化研究[J]. 海峡科学, 2017, (7): 66–69.

[19] 黄享辉, 胡韧, 雷腊梅, 等. 南亚热带典型中小型水库浮游植物功能类群季节演替特征[J]. 生态环境学报, 2013, 22(2): 311–318.

[20] 董云仙, 谭志卫, 朱翔, 等. 程海藻类植物种群结构和数量的周年变化特征[J]. 生态环境学报, 2012, 21(7): 1289– 1295.

[21] 周驰, 周念来, 苗滕. 湖北省典型湖泊水生态现状与综合评价[J]. 中国水运(下半月), 2015, 15(8): 168–170.

[22] 宋伦, 宋广军, 王年斌. 辽东湾浮游生物粒径结构稳定性分析[J]. 中国环境科学, 2015, 35(10): 3117–3126.

[23] 侯伟, 黄成, 江启明, 等. 粤北三座典型中型水库富营养化与浮游植物群落特征[J]. 生态环境学报, 2011, 20(5): 913–919.

Study on the diversity of eukaryotic ultraplankton in typical water area of Huangshi City

YU Jiajun, DUAN Yuhan, LIU Kesai, LIU Xixia, HOU Jianjun, LI Yuntao*

Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China

In order to investigate the eukaryotic ultraplankton diversity in typical waters of Huangshi City in Hubei Province, the community composition and genetic diversity of eukaryotic ultraplankton in different typical water areas (Yangtze River, Qingshan lake, Qinggang lake and Cihu lake) in Huangshi City of Hubei Province in the summer of 2015 were studied, and amplified ribosomal DNA restriction analysis, DNA sequencing and the related statistical analysis were used. The results showed that there were significant differences in the diversity of the eukaryotic ultraplankton in the four water bodies. Diversity decreased with the increase of the degree of eutrophication in water. Sequencing results of dominant clones indicated that dominant groups were Cryptophyta, Chlorophyta, Pyrrophyta, Cryptomycota, Chytridiomycota, ciliate and some unclassified plankton. The dominant groups were different in different waters, and the phyla of dominant groups decreased with the increase of the degree of eutrophication in water. The diversity of the community was negatively correlated with total phosphorus.

eukaryotic ultraplankton; biodiversity; amplified ribosomal DNA restriction analysis; freshwater

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.01.018

Q89

A

1008-8873(2019)01-137-06

2018-01-29;

2018-03-30

国家自然科学基金项目(No.41171045); 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室开放基金项目; 国家级大学生创新创业训练计划项目(No.201510513021); 湖北师范大学创新团队项目(T201504)

于佳骏(1996—), 男, 内蒙古赤峰人, 学士, 主要从事淡水生态学研究, E-mail: yujiajun96@163.com

李运涛, 男, 博士, 副教授, 主要从事淡水生态学研究, E-mail: liyuntao@hbnu.edu.cn

于佳骏, 段钰涵, 刘科赛, 等. 湖北黄石典型水域超微型真核浮游生物多样性研究[J]. 生态科学, 2019, 38(1): 137-142.

YU Jiajun, DUAN Yuhan, LIU Kesai, et al. Study on the diversity of eukaryotic ultraplankton in typical water area of Huangshi City[J]. Ecological Science, 2019, 38(1): 137-142.