不同贮藏条件下羊肉菌群多样性分析

王守经 杜鹏飞 王维婷 柳尧波 胡鹏 汝医 孙苏军

摘要：为了解不同温度下贮藏羊肉细菌群落结构，明确温度条件对羊肉细菌多样性的影响，本试验利用高通量测序技术，分析冷藏（0±4）℃和冰温（-1.2±1）℃贮藏条件下羊肉菌群的多样性变化。结果表明，14个样品共获得优质序列591 754条，在6个分类学水平上共获得17 306个分类操作单元（OUT）;不同贮藏条件下，羊肉样品细菌的丰富度和多样性随贮藏时间的延长均呈下降趋势，冰温贮藏细菌群落的改变更明显;贮藏后期，羊肉优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），其中冷藏条件下分别占细菌总数的99.6%和0.4%，冰温条件下为75.5%和24.5%。

关键词：羊肉;细菌菌群;高通量测序;冷藏;冰温贮藏

中图分类号：S826：TS251.53文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）01-0085-06

Study on Bacterial Diversity of Mutton

under Different Storage Temperature

Wang Shoujing， Du Pengfei， Wang Weiting， Liu Yaobo， Hu Peng， Ru Yi， Sun Sujun

（Institute of Agro-Food Sciences and Technology， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province/Key Laboratory of

Novel Food Resources Processing， Ministry of Agriculture， Jinan 250100， China）

Abstract In this study， high-throughput sequencing technology was applied to investigate the structures of the bacterial communities of mutton stored under different temperature conditions and determine the effects of temperature conditions on bacterial diversity. The changes in the bacterial diversity of stored mutton under conditions of （0±4）℃ （refrigerated） and （-1.2±1）℃ （ice temperature） were measured. The results showed that a total of 591 754 high-quality sequences and 17 306 classification operation units （OUT） were obtained from 14 samples at 6 taxonomic levels. The bacterial richness and diversity of mutton samples showed a downward trend with the prolongation of storage time in different storage condition， and the change of bacterial community in ice temperature storage was more obvious. Proteobacteria and Firmicutes were the dominant bacteria community in the late storage period， and they accounted for 99.6% and 0.4% respectively under cold storage conditions， and were 75.5% and 24.5% under ice temperature conditions.

Keywords Mutton; Bacterial community; High-throughput sequencing; Cold storage; Ice temperature storage

温度是影响微生物生长繁殖的关键因素之一。控制温度来提高畜禽肉品质量和延长保质期，已成为畜禽肉类生产加工业的重要技术措施。目前我国肉品最普遍的产品形式正由冷冻肉、热鲜肉向冷鲜肉转换。冷鲜肉是指经过宰后成熟的畜禽分割肉，其贮藏、运输和销售过程一直处于 （0± 4）℃的低温冷链条件下，可以很好地保持肉的新鲜度和风味，货架期一般可达5～7 d或更长。另一种形式的低温肉是冰鲜肉，它是近几年兴起的一种新型食品贮藏保鲜技术。该技术把贮藏温度控制在0℃以下到该产品冰点之间的范围内，从而更高效地控制微生物生长和其他质量指标劣变，这项技术在不同食品上的应用研究已取得很大进展[1]。研究发现，冰鲜羊肉的货架期可以达到20 d以上[2，3]，而控制温度与真空包装、复合保鲜剂处理、有机酸处理等协同技术措施相结合能够获得更好的肉品保鲜保质效果[4-6]。

宏基因组学技术作为一种新兴的分子生物学工具，可以直接從样品中提取微生物的总DNA，通过高通量测序分析，实现对微生物多样性、种群结构、进化关系和功能性等信息的解析，既避免传统方法在微生物多样性研究中的局限性，又能够更客观地反映研究对象中微生物原始群落构相及动态变化过程，这项技术在许多领域已经开展广泛的研究工作[7-14]，但对羊肉贮藏过程中细菌多样性的研究相对较少。本试验对冷藏及冰温两种贮藏条件下细菌群落多样性及其变化动态进行研究，旨在为冷鲜和冰鲜羊肉产品的质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用羊为小尾寒羊。选择12～15月龄的去势公羊，宰后于0～4℃条件下成熟24 h，取后腿肉作试验样品。

1.2 主要试剂与仪器

DNA快速提取试剂盒（Fast DNA SPIN extraction kits）购自美国MP Biomedicals公司;引物由上海派森诺生物科技股份有限公司合成;Illumina MiSep，美国Illumina公司产品;NanoDrop ND-1000 分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific公司产品;BCD-215KS型冷藏箱，青岛海尔股份有限公司产品;LRH-100CL低温培养/贮藏箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理编号 砧板等用具于试验前均用75%乙醇消毒，分割刀具随时用75%乙醇消毒处理。按试验设计要求进行样品分割处理，剔除脂肪、筋膜后切分成5 g左右的肉块，分别装入无菌PE自封袋中密封，后放入冷藏（0±4）℃和冰温（-1.2±1）℃条件下贮藏。贮藏当天取样，冷藏样品每隔3 d取样一次，冰温贮藏样品每隔7 d取样一次。每次取出的样品，编号后立即放入 -70℃ 超低温冰箱中存储，样品编号详见表1。

1.3.2 DNA提取 利用DNA快速提取试剂盒提取样品细菌总DNA，运用NanoDrop ND-1000型分光光度计进行宏基因组DNA质量检测，用琼脂糖凝胶电泳进行纯化分离，提取的DNA样品贮藏在-20℃条件下备用。

1.3.3 16S rDNA PCR扩增 对贮藏过程中羊肉表面细菌菌落V4-V5区16S rDNA进行PCR扩增，正向引物为515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3），反向引物907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′），7 bp的样本特异性条形码被加入到引物中进行多重测序。PCR反应体系25 μL：5×Q5 reaction buffer 5 μL， 5×Q5 High-Fidelity GC buffer 5 μL，5 U/μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L引物2 μL，模板DNA 2 μL和 8.75μL双蒸水。PCR反应程序：98℃热变性 2 min ;98℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环;72℃延续反应5 min。对PCR扩增产物进一步纯化定量。

1.3.4 上机测序 定量混合好的扩增产物利用Illumina MiSeq测序仪测序，进行生物信息分析。本试验的测序工作和生物信息分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。

1.4 数据分析

将测序得到的原始数据用QIIME 1.7软件进行过滤处理，运用Mothur 1.31.2软件进行嵌合体检验，去除长度≤150 bp的序列、嵌合体序列等无效序列。在97%相似性水平下划定阈值，对有效序列划分操作分类单元（OTU），构建稀释曲线。

基于物种丰度的分析，应用Mothur 1.31.2软件计算Alpha多样性指数中的丰富度（Chaol、Ace指数）、覆盖率（Coverage）和多样性（Simpson、Shannon指数）。根据OUT的结果及分布，得到样品在各个分类学水平上（门、纲、目、科、属、种）的构成比例，进一步进行菌群结构分析。

2 结果与分析

2.1 样品测序结果及优质序列分布

通过对样品细菌16S rDNA V4-V5区基因扩增，测序过程中会产生许多点突变等测序错误，为保证后续分析结果的准确性，需要按照一定的原则对获得的有效序列进行更进一步的过滤和除去嵌合体处理，得到用于结果分析的优质序列（表2）。14个样品优质序列比例均在95%以上，这说明测定结果可信度高，能够比较准确地反映细菌菌群的丰度情况。随着贮藏时间的增加，冷藏样品和冰温贮藏的序列数均呈现先升高后下降的趋势，表明羊肉样品表面菌群丰度降低，趋于简单化。

试验共测得优质序列591 754条，序列长度集中分布在223～227 bp，其中数量最多的是225 bp（图1）。本试验测得结果的分布与所测16S rDNA的V4-V5区的条带长度相吻合。

2.2 操作分类单元及稀释曲线

由表3可以看出，在相似度97%条件下14个样品细菌总的OUT数量是17 306个，在门、纲、目、科、属、种6个分类水平上的分布，分别是 4 054、 4 035、3 855、3 130、1 838个和390个，无注释信息的4个。

在小于5 000条序列时，A2-1、A1-1和 A-1 -2样品的OUT数量随样品序列数的增加迅速上升，A、A-1-3和A-2-3样品OUT上升速度次之，其他样品OUT的增加速度缓慢。在 5 000～ 10 000个序列范围内，仅有A2-1样品OUT数量增加较快，但速度较前期下降，其他样品基本趋于平缓，此后所有样品均趋于平缓（图2）。说明本研究的取样深度足够，测序结果能够真实地反映样品表面的细菌群落情况。无论是冷藏还是冰温贮藏，随贮藏时间的延长，样品稀释曲线的变化更加平缓，冰温贮藏样品尤其明显。

2.3 Alpha多样性分析

Alpha多样性是指特定生态系统或区域内的多样性，OUT反映了样品细菌種类的丰富程度，而Chaol、Ace指数和Simpson、Shannon指数则表明细菌群落结构的变化情况。由表4可以看出，无论是从A至A-1-6的冷藏样品还是A至 A-2-7 冰温贮藏样品，其Chaol、Ace指数和Simpson、Shannon指数的变化情况是一致的，均呈先升高后下降趋势。从不同贮藏条件的影响来看，冷藏较冰温贮藏样品表面细菌群落结构更丰富。随着贮藏期的延长，总体来看样品细菌多样性降低，群落结构趋于简单。

2.4 不同贮藏条件下细菌群落结构分析

由表5可以看出，不同贮藏条件对各个分类水平细菌种类数量的影响作用不同。在（0±4）℃下，与对照A相比， A1-1、A-1-2样品细菌种类的数量，除在属和种水平以外，其他水平上都是增加的，而后又减少。在冰温贮藏条件下，A2-1样品出现种群数量增加，A2-2样品则下降，而后随贮藏时间延长，不同样品细菌种类数量小幅上升再下降。

门分类水平上统计得到42个细菌类群分布（图3），其中优势类群依次是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），分别占总数的76.3%、17.6%、1.5%和1.3%。在 A-1-6 样品中Proteobacteria的比例高达 99.6%、 Firmicutes仅为0.4%，而在A-2-7样品中Proteobacteria的比例为75.5%、Firmicutes为 24.5%。

进一步的分析结果表明，在属分类水平上统计得到的细菌数量多达540个属，其中优势菌群依次是莫拉氏菌属（ Moraxellaceae ）、假单胞菌属（ Pseudomonas ）、涅瓦均属（ Nevskia ）、热死环丝菌属（ Brchothrix ）和芽孢杆菌属（ Bacillas ），分别占总数的28.7%、25.7%、12.3%、10.4%和2.1%。从菌群分布情况看冷藏和冰温贮藏后期的优势菌群非常明显，以 Moraxellaceae 和 Pseudomonas 为主，其中A-1-6样品 Moraxellaceae 占98.4%、 Pseudomonas 占0.4%，在A-2-7样品中则为74.4%和0.9%，两者的差别主要表现在 Brochothrix 的数量上，A-1-6样品为0.3%，A-2-7样品则高达24.4%，说明温度条件对菌群结构的影响非常明显。

3 讨论与结论

江芸等[15]研究认为，肉的腐败很大程度上取决于初期自身假单胞菌的含量。王宁[16]研究发现冷却羊肉的腐败菌中，假单胞菌占29.25%。假单胞菌属是一种需氧嗜冷性细菌，在低温有氧条件下很快就发展成为优势菌群，冷鲜肉的腐败绝大多数是由假单胞菌的大量繁殖引起的，在冷藏条件下贮藏末期假单胞菌数量会占到腐败菌的90%以上。热死环丝菌是一重要的肉类腐败菌，具有微需氧特性，它在引起无氧包装肉的腐败中起到重要作用，它是一种在低温下能够快速繁殖的腐败微生物，通常被认为是在冷藏条件下引起真空包装产品腐败的主要微生物[17]。本试验得出，无论是冷藏还是冰温贮藏，羊肉中优势菌群非常明显，变形菌门的假单胞菌和厚壁菌门的热死环丝菌占绝对优势，由于受不同温度的影响，两种细菌的比例变化较大。本试验虽采用有氧包装，但冰温贮藏条件下羊肉的贮藏期更长，其原因是，随着氧气的消耗假单胞菌的生长繁殖受到抑制，热死环丝菌快速生长繁殖，造成冰温贮藏羊肉中热死环丝菌的比例大大高于冷藏羊肉。

本试验综合分析可得，在冷藏和冰温条件下，羊肉中腐败细菌的丰度和菌群多样性均随贮藏时间的增加呈逐渐下降趋势，冰温贮藏下更加明显;在门分类水平上，冷藏18 d时羊肉中的优势菌群是变形菌门（Proteobacteria，99.6%）和厚壁菌门（Firmicutes，0.4%），冰温贮藏49 d时优势菌群仍然是Proteobacteria和Firmicutes，分别占75.5%和24.5%，这表明冷藏和冰温条件对贮藏后期细菌的菌群构成产生了明显影响。

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