爬沙虫主要营养成分分析及其抗利尿作用

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(1.西南民族大学药学院，民族药物研究所，四川成都 610041;2.乐山师范学院生命科学学院，四川乐山 614004)

爬沙虫是广翅目巨齿蛉属(Acanthcorydalis)和部分大型齿蛉属(Neoneuromus)幼虫的俗称，主要分布于四川攀西及云南大理、丽江、西双版纳等地[1]，民间认为爬沙虫营养丰富，在攀西地区享有“虫参”、“安宁土人参”和“动物人参”的美誉[2-3]。课题组考证表明，爬沙虫在彝族、白族、哈尼族、纳西族等多民族长期使用，不仅是一种特色食用昆虫，还是一味民间药，具暖肾阳、疗肾虚之效，是治疗小儿遗尿、老人体虚夜尿的特效药[4-5]。然而，目前对于爬沙虫的药用价值相关的研究极少，仅吉首大学研究发现爬沙虫提取液可提高果蝇繁殖力及寿命，同时，一定浓度爬沙虫提取液可提升小鼠繁殖力[6-7]。

目前，世界上可作食用的昆虫种类达3000种以上[8]。2003 年联合国粮食(WHO)与农业组织(FAO)推动食用昆虫的利用，预示着昆虫正在扮演新型蛋白资源及食物资源的角色[9-11]，具有巨大的研发潜力[12]。同时，研究表明多数食用昆虫兼具药用价值[13]。然而，目前对于食用昆虫的研究主要集中于其营养成分的研究[14-15]，对药理活性较少，许多药食两用昆虫药用价值尚缺实验依据。

下尿路症状(LUTS)储尿期症状临床上主要表现为尿频、尿急、夜尿、尿多等[16]，可引发包括前列腺疾病、膀胱过度活动症、夜尿症等疾病[17-20]。目前临床上治疗LUTS储尿期症状的药物主要有去氨加压素、抗毒蕈碱药、α-受体阻滞剂、M受体拮抗剂等[21-23]。然而，此类药物具有易引起患者口干、便秘、视觉模糊、眩晕、肠胃不适、排尿困难、心悸、性功能障碍等副作用[24-25]，尤其不适于老人及儿童使用。而来自天然的食用资源具有毒副作用低、可接受度高等优点，因此，以食用资源为思路，开发一种具有良好抗利尿作用的药食两用资源对LUTS储尿期症状的治疗具有重要意义。然而，目前国内外尚无相关学者对爬沙虫抗利尿作用进行研究。故本研究对食用昆虫爬沙虫主要营养成分进行分析，并研究其抗利尿作用，以期促进爬沙虫资源的全面开发，为爬沙虫的食用与药用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

爬沙虫 于2017年12月购自云南西双版纳，保存于西南民族大学416实验室冰箱冷冻层，经乐山师范学院生命科学学院曹成全教授鉴定为爬沙虫主流品种之一的属模巨齿蛉Acanthacorydalisasiatice(Wood-Mason，1884);健康雄性SD大鼠、KM小鼠雌雄各半，SPF级 均购自成都达硕实验动物有限公司(动物合格证号SCXK[川]2015-030)，动物分组分笼饲养于正常环境中，温度18～25 ℃，相对湿度为60%±5%，标准饲料喂养，可自由摄食、饮水;缩泉丸 吉林龙鑫药业有限公司;大鼠酶联免疫AVP、ALD试剂盒 美国R&D公司;0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)pH6.5(自配);牛血清蛋白(≥98%)对照品，西宝生物科技股份有限公司;无水葡萄糖 成都德斯特生物技术有限公司。

DZKW-4电子恒温水浴锅 北京中兴伟业仪器有限公司;722可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司生产;UPH-Ⅱ-10T优普超纯水制造系统 成都超纯科技有限公司生产;RJ-TGL-16G台式高速离心机 无锡市瑞江分析仪器有限公司;SL-100高速多功能粉碎机 浙江省永康市松青五金厂;MB-580酶标分析仪 深圳市汇松科技发展有限公司;L-8900全自动氨基酸分析仪 日本日立公司;PD-1C-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;代谢笼 自制。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 爬沙虫洗净后于-40 ℃冷冻干燥机中干燥72 h，置粉碎机内打粉5 min，过60目筛，粉末置0 ℃冷冻保存备用。

1.2.2 可溶性蛋白含量的测定 对照品溶液的制备：取牛血清蛋白对照品0.025 g，加纯水100 mL，制成0.25 mg/mL的对照品溶液。

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标准曲线的绘制：准确吸取对照品溶液取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL,定容至1.0 mL，加5 mL考马斯蓝，反应5 min。另取蒸馏水1.0 mL，同上操作加入5 mL考马斯蓝进行显色反应，作为空白对照。于最大吸收波长595 nm处测定吸光度，以牛血清蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线：y=0.0143x+0.0561，R2=0.9995。

称取爬沙虫粗粉2 g，置具塞锥形瓶中，加入50 mL蒸馏水，60 ℃水浴2 h，抽滤，取滤液，重复提取3次，合并滤液，将滤液浓缩至50 mL，浓缩液于5000 r/min离心15 min，取上清液即得蛋白样品液。取0.1 mL样品液纯水定容至1 mL，加考马斯亮蓝工作液5 mL，混匀后于595 nm处测定吸光度，代入标准曲线中计算蛋白含量[26-27]。

1.2.3 多糖含量测定 对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成92.9 mg/100 mL的溶液，即得。

标准曲线的绘制：准确吸取对照品溶液20、40、60、80、100 μL,分别置于比色管中，加蒸馏水定容至1.0 ml，加入5 %苯酚1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，沸水浴15 min。另取蒸馏水1.0 mL，同上操作加入5 %苯酚和浓硫酸进行显色反应，作为空白对照。于最大吸收波长490 nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线：y=0.007x-0.0429，R2=0.9932。

称取爬沙虫粗粉2 g，置索氏提取器中，加入石油醚150 mL于90 ℃水浴下回流提取2 h，弃去石油醚，收集残渣，挥干溶剂，置圆底烧瓶中，加水50 mL，50℃水浴回流提取2次，每次2 h，合并提取液，将提取液浓缩50 mL。精密吸取上法操作所得溶液1 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液，摇匀后快速加入浓硫酸5 mL，沸水浴15 min后冷却，得多糖供试液，于490 nm处测定吸光度，带入标准曲线中计算多糖含量[28]。

1.2.4 油脂含量测定 称取爬沙虫粗粉2 g，记为M，粉末包于滤纸内，置索氏提取器中，加入50 mL乙醚，沸水浴加热回流8 h至油脂提取完全，将提取液至于恒重蒸发皿中，蒸发皿质量记为mL，100 ℃水浴挥干乙醚，后烘箱内100 ℃烘干至恒重，称定蒸发皿加油脂重量，记为m2，根据下式计算出爬沙虫油脂含量。

1.2.5 有机酸含量测定 称取爬沙虫粗粉2 g，记为M，加30 mL 95%乙醇，于索式提取器中80 ℃水浴提取2 h，提取液浓缩至10 mL，取浓缩液1 mL稀释5倍，稀释液加0.5 g活性炭脱色30 min，随后加入酚酞指示液2滴，用0.1 mol/L氢氧化钠滴定至溶液出现粉红色为止，记录氢氧化钠体积V。每1 mL 0.1 mol/L NaOH滴定液相当于6.404 mg的枸橼酸，爬沙虫有机酸含量以枸橼酸含量表示，根据下式计算有机酸含量[29-30]。

1.2.6 水分及氨基酸含量测定 水分采用直接干燥法测定，称量爬沙虫鲜虫重量，随后将爬沙虫鲜虫置于40℃烘箱中干燥24 h至恒重，称量干虫重量，根据下式计算爬沙虫水分含量。

氨基酸测定参照GB/T 5009.124-2003中《食品中氨基酸的测定》，采用蛋白水解液于氨基酸自动分析仪中测定氨基酸含量[31]。

上述实验均平行进行3次。

1.2.7 爬沙虫抗利尿作用

1.2.7.1 药液的制备及动物筛选 爬沙虫粉末用0.5%羧甲基纤维素钠溶液分别配制为67.2、33.6、16.8 mg/mL混悬液，阳性药缩泉丸以相同方法配制为150 mg/mL混悬液，药液均置于4 ℃冰箱备用，用时摇匀。仿Aston法对SD大鼠进行筛选，即于实验前12 h禁食不禁水，每只大鼠灌胃38 ℃纯水22.5 mL/kg，收集灌胃2 h之后的尿液，凡尿量超过灌注体积40%者即为合格[32]。

1.2.7.2 分组及给药 取筛选合格大鼠48只，随机分为正常对照组、水负荷模型组、阳性对照组、爬沙虫混悬液高、中、低剂量组。高剂量组采用67.2 mg/mL爬沙虫混悬液液、中剂量组为33.6 mg/mL爬沙虫混悬液、低剂量组为16.8 mg/mL爬沙虫混悬液、阳性药组为150 mg/mL缩泉丸混悬液，分别按10 mL/kg灌胃给予大鼠，给药干预20 d，空白组、模型组灌胃等体积生理盐水。给药第19 d当晚，大鼠禁食不禁水12 h过夜，除空白组外，各组于第20 d给药后1 h按大鼠体重(50 mL/kg)灌胃生理盐水造成水负荷[33-36]，随后将所有大鼠置于代谢笼内测定0～5 h每小时尿量。根据下式计算尿量体重比及排泄率。

1.2.7.3 血清指标测定 实验结束后，大鼠股动脉取血，血样于4 ℃冰箱内放置1 h，随后3500 r/min离心10 min，收集血清。血清抗利尿激素(AVP)、醛固酮(ALD)含量的检测均按试剂盒说明书进行操作。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 爬沙虫常规营养成分

营养成分结果见表1，由表1可知，爬沙虫水溶性蛋白、多糖含量分别为4.87%±0.03%、1.90%±0.09%，油脂、有机酸、水分含量分别为16.45%±0.70%、3.54%±0.06%、71.51%±0.66%。目前，动物蛋白及多糖已被证明具有多种生物活性。动物蛋白可分离出多种活性肽，这类活性肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用，同时，有研究表明昆虫体内存在抗利尿肽[37-39]，由此推测爬沙虫抗利尿作用的产生可能与其体内存在的某种肽类物质有关;动物多糖亦被证明具有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖血脂、抗氧化抗衰老等作用[40]，爬沙虫多糖也可能是其具有药用价值的原因之一。

表1 爬沙虫常规营养成分的含量Table 1 Nutritional components contents in hellgrammites

2.2 爬沙虫氨基酸含量分析

爬沙虫20种常用氨基酸含量测定结果见表2，由表2可知，爬沙虫水解后共测出14种氨基酸，其中必需氨基酸7种，非必需氨基酸7种，总氨基酸含量为52.01 g/100 g。爬沙虫含有的鲜味氨基酸如丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸的含量决定了味道的鲜美程度[41-42]，而爬沙虫氨基酸中，丙氨酸含量最高，达7.46%，天冬氨酸、精氨酸的含量分别为6.10 g/100 g和2.03 g/100 g，鲜味氨基酸占总氨基酸含量的29.98%，这可能是爬沙虫味道鲜美，当地人喜食的原因所在。同时，爬沙虫药效氨基酸含量较高，为25.62 g/100 g，占总氨基酸含量的49.26%，这表明爬沙虫具有较好的药用及保健的开发价值。此外，爬沙虫中EAA/TAA=48.18%，EAA/NEAA=92.99%，与WHO/FAO提出的优质蛋白中EAA/TAA不低于40%，EAA/NEAA不低于60%相符[43]，表明爬沙虫氨基酸配比合理，可做为优质蛋白的选择。

表2 爬沙虫的氨基酸含量Table 2 Amino acids composition in hellgrammites

采用氨基酸比值系数法对爬沙虫中必需氨基酸与WHO/FAO提出的理想人体必需氨基酸模式谱进行比较，比较结果见表3。由表3可知，爬沙虫中各必需氨基酸均高于WHO/FAO标准[37]，这进一步说明了爬沙虫具有很高的营养价值。其中苯丙氨酸与酪氨酸含量约为WHO/FAO标准的3倍，苯丙氨酸可经氧化产生成为酪氨酸，两者可一起参与神经递质与激素的合成，参与机体的糖代谢及脂代谢，这可能与民间与爬沙虫的药用价值存在一定的联系。

表3 必需氨基酸占总氨基酸的含量及其与WHO/FAO标准对比Table 3 Content of essential amino acids in total aminoacids and comparison with WHO/FAO standards

2.3 抗利尿作用研究

2.3.1 对大鼠尿量的影响 由表4可知，模型组尿量体重比较之正常组显著增加(p<0.01)。0～1 h内，中、低剂量组尿量体重比极显著高于模型组(p<0.01)，高剂量组、阳性药组与模型组比较无显著差异，说明尚未起效;1～2 h内，除低剂量组外，各给药组尿量体重比均显著低于模型组(p<0.05);2～3 h各给药组均起效，尿量体重比均显著低于模型组(p<0.05)。2 h后，爬沙虫低剂量组排尿量极显著低于阳性药组(p<0.01)，3～4 h中、低剂量组排尿量均极显著低于阳性药组(p<0.01)。通过观察发现，高剂量组5 h中排尿规律与阳性药组几乎一致，但5 h尿液总量较之阳性药组降低了10.48%，说明爬沙虫在水负荷条件下的抗利尿作用略强于阳性药，具有较好的开发价值。各组总尿量体重比较之模型组均显著降低(p<0.05)，各给药组较之模型组尿量体重比降低率分别为高剂量组30.08%、中剂量组29.65%、低剂量组19.27%以及阳性药组19.60%。

表4 爬沙虫对水负荷大鼠尿量的影响Table 4 Effect of hellgrammites on urine volume of water-loaded

由表5可知，各给药组排泄率均显著低于模型组(p<0.01)，以平均值计算各给药组较之模型组的降低率，得到降低率分别为高剂量组30.36%、中剂量组25.39%、低剂量组18.89%以及阳性药组23.21%。爬沙虫高剂量组排泄率较之阳性药组降低了7.15%，但各给药组与阳性对照组之间未见显著性差异。抗利尿效果根据排泄率进行排序，抗利尿效果为爬沙虫高剂量组>中剂量组>阳性药组>低剂量组。

表5 爬沙虫对水负荷大鼠排泄率的影响Table 5 Effect of hellgrammites on theexcretion rate of water-loaded

2.3.2 对AVP、ALD的影响 如图1所示，模型组AVP含量较之空白组极显著降低(p<0.05)，高剂量组极显著高于模型组(p<0.01)，其余各组较之模型组AVP含量升高但未见显著性差异(p>0.05)，高剂量组AVP含量较之阳性药组有所升高，但未见显著性差异。模型组ALD含量较之空白组显著降低(p<0.01)，各给药组ALD含量较之模型组均显著升高(p<0.05)；各给药组与阳性对照组间未见显著性差异。

图1 爬沙虫对水负荷模型大鼠血清AVP、ALD含量水平的影响Fig.1 Effects of hellgrammites on the content of AVP and ALD in serum of water-loaded

精氨酸加压素(AVP)又称抗利尿激素(ADH)，为一种9肽物质，它能与远曲小管和集合管上皮细胞管周膜的特异受体结合，激活膜内的腺苷酸环化酶，使上皮细胞中环磷酸腺苷增加，导致管腔膜内蛋白激酶激活，使蛋白磷酸化改变膜的构型，导致水通道开放，增加管腔膜对水的通透性，促进水重吸收，从而起到减少尿量的作用[8]。有研究表明，自然衰老大鼠血中ADH明显减少[19-21]，老年人夜间AVP释放水平降低，夜间多尿是常见症状[44]。本次实验中，与模型组比较，爬沙虫高剂量组大鼠血清AVP含量显著升高(p<0.05)，中剂量组及低剂量组亦有所升高，升高程度排序为高剂量组>中剂量组>低剂量组，这与爬沙虫抗利尿效果的排序相一致，可推测爬沙虫抗利尿作用可能是通过促进AVP释放来实现的。

醛固酮(ALD)是肾上腺盐皮质激素的主要成分，是由肾上腺皮质球状带细胞合成的一种甾体激素，主要作用为保钠排钾，从而减少尿液的排泄[16-17]。本次研究的结果表明，与模型组对比，爬沙虫各给药组ALD含量均显著升高(p<0.05)，升高程度排序为低剂量组>中剂量组>高剂量组，这与爬沙虫抗利尿作用效果排序相反，推测爬沙虫可能不是通过促进ALD的释放起到抗利尿作用。

3 结论

通过对爬沙虫的营养成分分析表明其营养丰富，其中可溶性蛋白、多糖含量可观，氨基酸配比合理，各必需氨基酸含量均超高于WHO/FAO标准，可作为优质蛋白的原料选择。同时，这些含量丰富的成分不仅是营养物质，也往往是药用昆虫的生物活性物质，如蜂肽、天蚕素类抗菌肽、土鳖虫多糖以及白蜡虫多糖等。本研究中爬沙虫冻干粉表现出了良好的抗利尿活性，实验表明其冻干粉可明显减少大鼠尿量，这种作用的产生可能是通过调节大鼠体内的一种9肽物质——抗利尿激素(AVP)来实现的，而这种药用活性的物质基础是否与爬沙虫的蛋白类、多糖类物质有关，值得进一步研究。