生物炭对沼渣堆肥理化性状及微生物种群变化的影响

张海滨，孟海波，沈玉君，赵立欣*，周海宾，丁京涛

（1 天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2 农业部规划设计研究院农村能源与环保研究所/农业部资源循环利用技术与模式重点实验室，北京 100125）

在厌氧环境下，有机废弃物在微生物作用下经过发酵产生沉积物，即沼渣。沼渣营养物质丰富，是优质的农田填料，但不合理的处理会造成环境污染，资源浪费。据不完全统计，2005年至2015年期间我国沼气工程由1.2万处猛增至11.09万处，沼渣数以千万计[1]。沼渣制肥是解决沼渣资源化利用、防止二次污染的有效途径。沼渣以难降解有机物为主，例如纤维素类物质[2]，不适合单独好氧发酵，通过添加污泥、畜禽粪便[3-4]、微生物菌剂[5-6]等方法，可以提高沼渣堆肥腐熟效果，达到有机肥标准。

生物炭富含有机质，具有微孔结构[7-11]，是堆肥过程中理想的添加材料，有利于改变堆肥环境并提高堆肥产品的品质。有研究表明，猪粪堆肥中添加9%的竹炭可以提高约65%的总氮含量[12-13]；同时，向畜禽粪便中添加生物炭可以促进堆肥腐熟，加速有机物降解，提高腐殖酸含量[10,13]；生物炭的添加还可以促进微生物繁殖，提高微生物数量，进而改善堆肥条件[14]。

然而，生物炭对沼渣堆肥理化特性的影响缺乏研究，生物炭如何影响微生物数量还未见报道。本研究以生物炭为添加剂，研究生物炭对沼渣堆肥过程中理化性质、微生物数量及堆肥腐熟的影响，以期为生物炭基沼渣肥的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 堆肥原料

沼渣取自北京大兴区留民营鸡粪沼气工程 (干发酵，沼渣经固液分离处理)，猪粪取自大兴青云店，玉米秸秆取自北京市大兴区青云店镇孝义村周边农田；生物炭购于河南商丘三利公司，由果木于550℃高温热解2 h制得。供试材料理化性质详见表1。

1.2 堆肥设备

堆肥设备采用农业部规划设计研究院自主研发发酵罐，为双层圆筒状结构，由不锈钢制成，顶部密封，为密闭式堆肥反应器。堆肥设备外径45 cm，高46 cm，管壁厚5 cm，容积为60 L。试验过程中通过鼓风机曝气，提高氧气浓度，曝气风速0.1 m3/(m3·min)，每个堆肥设备布设三个专用温度传感器，分别连续监测上、中、下三个不同高度堆体温度。根据经验值设计堆肥设备自动化曝气时长5 min、间隔40 min，采用时间反馈控制好氧发酵 (图1)。

表1 堆肥原料理化性质Table 1 Physical and chemical characteristics of compost materials

图1 强制通风静态垛堆肥反应器示意图Fig. 1 Sketch map of static pile composting reactor with mandatory ventilation

1.3 试验设计

以沼渣为主要堆肥原料，添加猪粪调节氮含量，以1 cm左右玉米秸秆为调理剂，控制物料C/N为25∶1，含水率控制在65%～70%，在室温25℃下堆置30 d。试验共设4个处理，F1、F2、F3分别添加2%、5%、10%比例的生物炭，以CK为对照，生物炭添加量按物质干重比计算，具体见表2。

表2 不同原料配比 (kg)Table 2 Different raw material ratios

1.4 样品采集

堆制过程中，利用温度反馈自动控制系统每30 min自动记录堆体温度，并在堆肥不同阶段分别监测堆体电导率、pH值、腐殖质的变化，堆肥结束后测定有机肥产品行业指标及种子发芽指数。堆肥过程中分别在1、2、4、8、12、16、20、30 d采集堆肥样品300 g，每次样品分成2份，一份保存在-80℃微生物保存冰箱中待用，一份用于检测各理化指标。各指标做3次平行。

1.5 测定方法

1) 堆肥温度：用温度反馈自动控制系统实时监测并记录。

2) pH值、电导率 (electrical conductivity，EC)：称取过Φ1 mm筛的风干样5.0 g于100 mL烧杯中，加50 mL水 (经煮沸驱除二氧化碳)，搅动15 min，静置30 min，用pH计测定pH，用电导率仪测定EC。

3) 种子发芽率指数 (germination index，GI)：取堆肥浸提液20 mL，倒入垫有滤纸的培养皿中 (对照取20 mL清水)，取30粒油菜种子于 (20±1)℃恒温恒湿培养箱中培养48 h测定发芽率[15]。

4) 腐殖质含量：重铬酸钾—硫酸法。

5) 微生物数量：荧光定量PCR (绝对定量)，由北京美吉桑格生物科技有限公司测定。

1.6 数据处理

采用Origin10.0软件进行作图分析，采用SPSS statistics19.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 堆肥过程中温度的变化

图2显示，四组处理温度均经历了“上升—下降—稳定”的变化过程。这是因为升温期，微生物快速分解利用堆体中易降解有机物，大量繁殖并产生大量热能，堆肥温度迅速上升；进入高温期温度达到55℃以上，导致大量微生物失活，并在曝气作用下水蒸气带走大量的热能，堆肥温度开始下降；微生物复苏以后，堆肥开始腐熟，发酵过程结束[16]。随着生物炭添加比例的增加，各堆肥处理最高温度分别达到57.28℃、59.54℃、61.02℃、57.2℃；处理F1、F2不仅可达到55℃以上，而且高温持续时间在6天左右，堆肥可达无害化标准；但处理F3、CK维持时间仅3天，达不到无害化标准 (好氧堆肥无害化工艺条件：堆层温度55℃以上需维持3天以上[17])。

添加生物炭沼渣堆肥与普通堆肥对比，可以更快的达到高温期，延长高温期时间。F3处理与F1、F2、CK相比较，最高温度可以达到61.02℃，但高温期维持时间短，达不到无害化要求。这主要是因为生物炭的微孔结构可以增加持水性，较高的含水率有利于保温；而过高的生物炭添加比例会增加堆体孔隙率，在高温曝气的情况下，会加速水分的流失，不利于保温，从而导致温度高而时间短[18]。

图2 堆肥过程中温度的变化Fig. 2 Changes in temperature during the composting

2.2 堆肥过程中pH、EC的变化

图3 显示，堆肥初期各处理的pH值在8.55～8.80之间，且后期变化趋势相同，均呈先上升，后下降，最后趋于平缓趋势。堆肥过程中，F1处理pH值始终大于其它三组处理，处于较高水平(＞8.7)，且升温期达到pH最大值9.03，这说明F1有机质分解较快，产生大量NH3，NH4·OH的存在导致pH值的升高；CK处理pH值始终处于低水平，堆肥后期达到最小值8.34。

图3 堆肥过程中pH和电导率的变化Fig. 3 Variation of pH and EC during composting

堆肥重要因素之一是可溶性盐的浓度 (EC)，主要以离子态存在于浸提液中，且对作物具有毒害作用。研究显示，堆肥腐熟的指标之一是不超过电导率限值4.0 mS/cm[19]。由不同处理电导率变化（图3）可知，沼渣经过二次发酵，所有处理电导率均低于1 mS/cm (沼渣经过初次厌氧发酵，大量可溶性盐进入沼液)，变化趋势与pH相似，表现为升温期上升，高温期达到最大值，降温期下降趋于平缓；四组处理电导率均在降温期达到最小值，依次为F3＞CK＞F2＞F1，F1处理电导率最低，在0.6 mS/cm左右。

图3显示，生物炭对pH、EC具有显著影响。CK处理pH始终处于低水平，生物炭的添加促进了微生物的繁殖，分解有机物产生大量NH3和小分子有机酸，碱化作用大于酸化作用，引起pH上升；进入高温期以后，微生物活性降低，小分子有机酸酸化作用凸显，pH降低；降温期温度下降以后，小分子有机酸被逐渐矿化降解，堆体的pH值稍有升高并趋于稳定。堆肥过程中EC变化趋势与pH变化趋势类似，但是EC下降速率较快，主要原因是生物炭对盐基离子具有一定的吸附作用，减少水溶性盐含量；同时，微生物对盐基离子具有降解作用[4]。因此，适当地添加生物炭可以延长高温期，降低EC值。

2.3 堆肥过程中微生物的变化

2.3.1 细菌 图4显示，堆肥过程中细菌总量在升温期与降温期分别达到最大值，产生两次波峰，高温期细菌总量降低，这是由于堆肥初期微生物利用易降解有机物，如可溶性单糖、粗蛋白大量繁殖；高温期温度达到55℃以上；高温阶段大量细菌失活，导致微生物数量急剧减少；降温阶段温度下降，周围环境再次适宜微生物的生长，细菌复壮；但堆肥后期有机物较难降解，无法满足细菌的生长需要从而导致细菌总量再次减少。微生物数量表现出升温期急剧增长，高温期减少，后期再增长的趋势；堆肥前期 (0～8 d) F1 ＞ CK ＞ F2 ＞ F3，堆肥后期(9～30 d) F1 ＞ F2 ＞ F3 ＞ CK；其中，F1 处理细菌数量远多于其它三组处理，CK处理在堆肥前期 (0～8 d) 细菌数量要高于F2、F3处理，但堆肥后期 (9～30 d) F2、F3处理反而超过CK处理，说明生物炭特有的微孔结构给细菌提供了有利于细菌生长的微环境[20-21]。2.3.2 放线菌 整个堆肥过程中，放线菌变化趋势与细菌类似，呈“上升—下降—再上升”趋势，但在数量上比细菌低两个数量级；堆肥过程中，放线菌微生物量 F1 ＞ F3 ＞ CK ＞ F2，F1 处理放线菌数量显著多于其它处理，F2处理始终处于低水平，F3处理处于中间水平 (图4)。这可能是由于生物炭不但具有保护微生物、提供微环境的优势，同时具有相对减少碳源的劣势，影响微生物生存；当优势大于劣势，对微生物产生正作用，反之，产生负作用。

图4 堆肥过程中微生物数量的变化Fig. 4 Changes of microbial quantity during composting

2.3.3 真菌 由图4可知，在数量上，真菌远比细菌、放线菌要少，且真菌对堆肥环境的变化更加敏感，因此，堆肥过程中真菌的变化较为明显。堆肥过程中，真菌的数量 F3 ＞ F2 ＞ F1 ＞ CK，CK 处理真菌数量最低，真菌数量与生物炭添加比例成正比，生物炭对真菌具有保护作用，提供了适宜的微环境。

2.3.4 微生物总量 四组处理变化趋势相同，堆肥微生物中，细菌占比较大，细菌比放线菌要高2个数量级，比真菌要高6个数量级，因此微生物总量的变化趋势与细菌类似，先上升后下降再上升；而F1处理生物量远高于其它处理，升温期 (1天) 达到最大值5.14×1011cfu/g，高温期 (8天) 达到最小值0.8×1011cfu/g。堆肥过程中，堆肥初期主要降解一些易降解有机物，微生物增殖迅速，温度在1天内达到50℃，pH、EC等理化指标同时呈上升趋势；达到高温期 (55℃以上) 以后，严重影响微生物生理活性，微生物数量减少，随着降解活动的减少，pH、EC等理化指标开始下降，温度达到顶峰以后也开始下降；随着温度的降低，堆肥环境逐渐适宜微生物生长，微生物开始繁殖，堆肥达到腐熟阶段，温度、pH、EC变化趋势趋于平缓。

微生物是堆肥过程中的主要参与者，与堆肥环境之间具有相互作用[22-25]，与有机物的降解、腐熟息息相关。堆肥温度与微生物之间是相互影响的，微生物的生长繁殖势必会引起堆肥温度的变化，且适宜的堆肥温度有利于微生物的生长，而高温会产生抑制作用。由图2可知，堆体在第4天达到55℃，第11天温度下降到55℃以下；微生物总量在第4天达到谷值，第11天开始回升；微生物增长出现两次峰值，一次出现在升温期，一次出现在降温期，变化趋势与温度相反，体现了温度与微生物之间的相互影响作用。

细菌作为沼渣堆肥过程中的主要微生物，相比于真菌、放线菌，大的比表面积可以提高细菌对可溶性底物的利用效率，加快细菌繁殖[26]，在数量上远高于真菌、放线菌；细菌量堆肥前期 (0～8 d) F1 ＞CK ＞ F2 ＞ F3，堆肥后期 (9～30 d) F1 ＞ F2 ＞ F3 ＞CK，说明细菌与生物炭添加量之间呈负相关，过量的生物炭并不利于细菌的生长，生物炭具有较低的生物有效性[27]，难以被细菌降解利用，同时存在于生物炭中的有毒挥发性物质对细菌具有毒害作用[28-29]，从而对细菌生长产生负作用。

放线菌具有发达的菌丝和细胞壁，很少利用纤维素，但它们可以容易地利用半纤维素，并在一定程度上分解木质素，放线菌还可以耐受高温和碱性环境[30-31]。沼渣堆肥过程中，放线菌数量F1 ＞ F3 ＞CK ＞F2，说明生物炭对放线菌的影响呈上凹型，适量生物炭对放线菌有最高的抑制作用。这是因为生物炭除了直接提供微生物生长场所以外，还可能引起沼渣堆肥理化性质的改变、养分含量与有效性的增减等[32-33]，这些改变会导致放线菌发生不同的生长代谢反馈，改变生长分布状况，最终导致放线菌数量不同的变化趋势[34-35]。

真菌对于沼渣堆肥物料的腐熟和稳定具有重要意义[2]。研究表明，真菌的生长繁殖受堆肥温度的影响显著，绝大部分的真菌是嗜温性菌，其最适温度为25～30℃。对于真菌微生物量，堆肥过程中F3 ＞F2 ＞ F1 ＞ CK，说明生物炭对真菌的影响呈正相关，添加生物炭有利于真菌生长，主要原因是生物炭的高芳香化表面、孔隙结构及对水肥吸附作用使其为真菌栖息提供良好的“微环境”[36-37]，有利于真菌生长，从而提高真菌数量。综合试验结果表明，F1对沼渣堆肥微生物总量具有最大正相关性，显著促进堆肥腐熟。

2.4 堆肥过程中腐熟度的变化

图5显示，腐殖质含量总体表现为先减少后增加的趋势，呈“V”字型，第11天达到最低值，F1始终处于较高水平，远高于其它三组处理 (F1 ＞ F2 ＞CK ＞ F3)，最高值达到24.08%，最低为17.92%，F3处于最低水平；与CK对比，F1、F2、F3处理腐殖质含量分别提高了8.12%、7.23%、7.43%。

图5 堆肥过程中腐殖质的变化Fig. 5 Changes in humus during the composting

沼渣堆肥过程中，腐殖质同时存在分解与合成的反应，堆肥初期微生物活性高、数量多，腐殖质中的一些小分子物质 (以富里酸为主) 被微生物分解、利用，大分子的腐殖质 (以胡敏酸为主) 累积，合成与分解处于一个大的动态平衡之中。图5表明，腐殖质的含量变化呈“V”字型，腐殖质的积累主要发生在堆肥后期，说明沼渣堆肥后期对于有机肥的腐熟、稳定是不可或缺的阶段，与孙向平[38]的研究一致。

单因素方差分析结果 (表3)表明，生物炭的添加显著影响腐殖质的形成 (P＜0.05)，与CK对比，F1、F2、F3处理腐殖质含量分别提高了8.12%、7.23%、7.43%。关于堆肥中腐殖质的形成，有研究认为存在两种途径：一是在微生物作用下，木质素的侧链氧化生成木质素类衍生物，构成了腐殖质的核心和骨架，这是腐殖质形成的重要途径之一[39]，二是由微生物代谢后的单聚体聚合而成[40]。两种途径均突出了微生物的作用，猜测生物炭通过影响沼渣堆肥微生物进而影响腐殖质的合成。

2.5 有机肥品质

由上可知，本试验中四组不同处理均达到高温期 (55℃以上)，F1、F2可满足无害化标准 (55℃以上维持3 d以上) ；与CK相比，F1、F2、F3有机质含量分别提高了12.96%、9.26%、7.41%，总养分含量分别提高了6.5%、4.3%、2.2%，且有机质含量均大于45%；四组处理pH值始终处于8.0以上，电导率低于1 mS/cm，由图6种子发芽指数变化可以看出，所有处理种子发芽指数均在85%以上，依次为F1 ＞ F2 ＞ F3 ＞ CK，无毒害作用；除含水率外，总养分、粪大肠菌群数、蛔虫卵死亡率等均符合中华人民共和国农业行业标准《NY525-2012有机肥料》[41]。堆肥结束后可以适当晾晒，调节含水率，达到有机肥标准(表4)。

表3 单因素方差分析Table 3 Variance analysis of single factor

图6 种子发芽指数Fig. 6 Germination index

3 结论

1) 生物炭能够延长高温期，提高有机质和总养分含量。

2) 添加生物炭可以有效降低细菌菌群数量，促进真菌生长，进而加快沼渣肥的腐熟，且提高沼渣堆肥腐殖质含量。

3) 综合试验结果，添加2%生物炭 (干基) 对促进堆肥腐熟、提高养分含量效果最显著。添加过多生物炭将不利于堆肥的腐熟。

表4 有机肥产品相关指标测定值及有机肥行业标准值 (干基)Table 4 Values of quality items of the produced organic fertilizers and the standards value by the organic fertilizer industry standard (Dry base)