多效唑和三碘苯甲酸对大叶黄杨根系和叶片氮积累的影响

韩丛蔚，徐程扬

（国家重点森林培育和植物保护实验室/半干旱与干旱重点实验室/北京林业大学，北京 100083）

氮既是植物生长的基本限制性因子，又是最重要的营养元素之一，它的有效利用可以增加植物的适应性。氮在植物体内通过根系的吸收、茎的运输，最终在叶片中同化，合成蛋白质和叶绿素等重要物质，为光合作用提供物质基础[1-2]，其中根是氮吸收的主要器管，叶片则作为氮汇成为含氮化合物的合成、分配场所[3]，因此研究根系和叶片的氮代谢变化原因具有重要意义。

绿篱植物和几何造型树木是城市园林绿化的重要成分，然而频繁的修剪极大提高了其管理成本，为降低成本，国内外学者在使用多效唑 (PP333)[4-6]、三碘苯甲酸 (TIBA)[7-8]等生长调节剂进行化学修剪方面开展了大量研究，并形成一些生产应用的产品[9]。PP333主要通过抑制赤霉素的生物合成从而降低树木枝条生长[10-11]，TIBA则通过抑制生长素极性运输起到延缓生长的作用[12]。目前，国内外学者关于植物生长延缓剂对矿物质养分元素在果树叶片中的积累[13-14]、根系吸收形态性状[15-16]的影响及其分子学机理[17-18]等方面进行了研究，但关于PP333和TIBA对氮在绿蓠植物体内分配机理方面的研究鲜见报道。

大叶黄杨 (Buxus megistophyllaLevl.)，别名黄杨木，是温带及亚热带树种，广泛栽培于我国中部及北部各省，由于其树形优美、可饰性强而具有极高的园林观赏价值，是城市中最常见的绿蓠植物之一。本试验以三年生大叶黄杨苗木为试验材料，采用双因素随机区组设计，研究PP333和TIBA对根系以及叶片内氮及其他形态氮物质含量分配规律的影响，以揭示大叶黄杨的氮分配对植物生长延缓剂的响应机理，旨在为绿蓠植物的化学修剪筛选合适药品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及试验材料

试验地设在北京林业大学妙峰山实验林场的普昭院苗圃地 (39°54′N、116°28′E)，位于北京市海淀区西北郊北安河乡境内，属典型的暖温带半湿润大陆性季风气候，年平均日照时数为2769 h，植物生长期222 d，无霜期180 d[19]。

2015年7月，将一年生大叶黄杨扦插苗栽植到苗圃地内。试验区为480 m2(24 m × 20 m)，幼苗按2 m ×2 m株行距栽植，试验区周围设置保护行，采用常规水肥管理。两年后选用健康且长势一致的大叶黄杨苗木作为试验材料。

1.2 试验设计

本试验采用两因素完全随机区组设计。因素A为多效唑(PP333)，设置包含空白对照的四个浓度水平：0(P1)、20 mg/L(P2)、50 mg/L(P3) 和 80 mg/L(P4)。因素B为三碘苯甲酸(TIBA)，设置包含空白对照的三个浓度水平：0(T1)、50 mg/L(T2) 和100 mg/L(T3)。自2017年4月5日起，每隔25 d对苗木进行不同浓度水平的PP333和TIBA两两配合喷施，每个试验小区喷施1 L溶液，至叶面两侧滴水为止，喷施时间选在晴天傍晚。试验共设12个处理(表1)，3次重复，每个小区20株苗木，共计36个小区、720株苗木。

1.3 取样及指标测定

2017年6月20日 (即第三次喷施25 d后) 进行全株取样，在每个小区选取苗高、地径接近该小区平均值的苗木6株，共取样216株，保持根系完整，置于冷藏箱中运回实验室。

将苗木冲洗干净后，根系与地上部分分开，并利用游标卡尺将根系按径级分为细根G1(D ≤ 2 mm)、中根 G2(2 ＜ D ＜ 5 mm) 和粗根 G3(D ≥ 5 mm)。取每个处理每个重复的3株合并，利用液氮与球磨仪粉碎根系、叶片，将磨好的鲜样装入离心管中放于超低温冰箱保存 (-80℃)。测定硝态氮含量采用硝基水杨酸比色法，游离氨基酸含量采用茚三酮比色法；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法；光合色素含量测定采用紫外分光光度法 (UV-2600分光光度计，日本岛津公司)。取每处理每个重复的另外三株合并后，分别将根系、叶片在105℃下杀青、80℃烘干至恒重，粉碎、过0.5 mm筛，样品经H2SO4-H2O2消煮后，采用凯氏定氮法 (UDK-152，美国VelpScientifica公司) 测定全氮含量。

表1 各处理中PP333和TIBA浓度及处理代码Table 1 PP333 and TIBA concentration in each treatment and the treatment codes

1.4 数据处理

采用SPSS22.0(美国IBM公司) 进行双因素方差分析，研究不同浓度PP333、TIBA及其交互效应对根系氮吸收和叶片氮分配的影响。当存在交互效应时，研究不同处理组合对该指标的影响，并用Tukey HSD(α = 0.05) 作为多重比较方法。若不存在交互效应，因素间差异性采用F检验 (α = 0.05) 结果表示。测定指标时将同一重复的6株苗木首先进行合并，因此以重复为单位进行分析，即n= 3。

2 结果与分析

2.1 PP333和TIBA对大叶黄杨根系氮吸收的影响

从PP333、TIBA对各径级根系全氮、游离氨基酸和硝态氮含量的F检验结果可知，施用PP333、TIBA以及同时施用PP333和TIBA使大叶黄杨G1径级根系总氮含量、游离氨基酸、硝态氮含量均发生了显著 (P＜ 0.05) 或极显著变化 (P＜ 0.01) (表2)，PP333还使G2径级根系总氮浓度、游离氨基酸、硝态氮含量发生显著变化 (P＜ 0.05)。

PP333对G2径级全氮含量、硝态氮含量、游离氨基酸含量有促进作用，但仅在PP333 80 mg/L梯度达到显著水平 (P＜ 0.05)，分别较PP333对照显著提高了32.90%、86.7%和49.52% (表3)。

表2 PP333、TIBA及二者交互效应对大叶黄杨根系含氮化合物影响的方差分析Table 2 ANOVA analysis on the effects of PP333, TIBA and their interaction on nitrogen-containing compounds in seedlings root of B. megistophylla

表4表明，各处理组合对G1径级根系氮吸收均有不同程度显著的促进作用 (P＜ 0.05)，其中，P3T3、P4T2和P4T3处理下的细根根全氮含量分别是空白组合的1.98、2.03、2.07倍，P3T2、P3T3、P4T2和P4T3使细根硝态氮含量提高了23.06%、22.71%、23.53%、23.14%，P3T2、P4T1、P4T2和P4T3处理下的细根游离氨基酸含量分别是空白组合的7.97、6.10、6.56和6.23倍。

表3 PP333的主效应对大叶黄杨根系含氮化合物的影响Table 3 Main effect of PP333 on nitrogen-containing compounds in seedlings root of B. megistophylla

表4 PP333和TIBA的交互效应对大叶黄杨根系含氮化合物的影响Table 4 Interactive effect of PP333 and TIBA on nitrogen-containing compounds in seedlings root of B. megistophylla

2.2 PP333和TIBA对叶片氮分配的影响

2.2.1 PP333和TIBA对全氮、可溶性蛋白、硝态氮和游离氨基酸含量的影响 施用PP333引起大叶黄杨叶片全氮含量、可溶性蛋白含量、游离氨基酸含量和硝态氮含量均发生极显著变化 (P＜ 0.01)(表5)；而施用TIBA仅引起全氮含量和可溶性蛋白含量发生极显著变化 (P＜ 0.01)。同时施用PP333和TIBA同样引起叶片的全氮含量和可溶性蛋白含量发生极显著变化 (P＜ 0.01)，且PP333对叶片各个含氮化合物指标的影响均大于TIBA。

PP333仅在80 mg/L对叶片硝态氮含量有显著促进作用 (P＜ 0.05)，较对照处理提高了10.71%；在PP333 50、80 mg/L梯度对游离氨基酸有显著促进作用 (P＜ 0.05)，较对照处理分别提高了31.05%和46.30%(表6)。

除P1T1、P1T2、P1T3和P2T1处理外，其余处理组合对叶片全氮和可溶性蛋白含量均有显著的促进作用 (P＜ 0.05)，其中P4T3处理的全氮和可溶性蛋白含量分别是空白组合的1.80倍和2.28倍 (表7)。

2.2.2 PP333和TIBA对光合色素含量的影响 氮在植物叶片的代谢过程中，通常有超过半数的氮会分配到叶绿体中参与光合作用，光合色素含量决定光合作用的强弱。施用PP333、TIBA均引起叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量和类胡萝卜素含量发生极显著变化 (P＜ 0.01)，同时施用PP333和TIBA引起叶绿素a、叶绿素总量和类胡萝卜素含量发生极显著变化(P＜ 0.01)，叶绿素 b 含量发生显著变化 (P＜ 0.05)，且PP333对各光合色素含量指标的影响均大于TIBA(表8)。

12个处理组合中仅P4T2和P4T3显著提高了叶绿素a和叶绿素总量，P4T1、P4T2和P4T3处理组合提高了叶绿素b和类胡萝卜素含量，且处理间差异显著 (P＜ 0.05, 表9)。

表5 PP333、TIBA及两者交互作用对大叶黄杨叶片含氮化合物影响的方差分析Table 5 ANOVA analysis on the effects of PP333, TIBA and their interaction on nitrogen-containing compounds in leaves of B. megistophylla seedlings

表6 PP333的主效应对大叶黄杨叶片含氮化合物的影响Table 6 Main effect of PP333 on nitrogen-containing compounds in leaves of B. megistophylla seedlings

表7 PP333和TIBA的交互效应对大叶黄杨叶片含氮化合物的影响Table 7 Interactive effect of PP333 and TIBA on nitrogencontaining compounds in leaves of B. megistophylla seedlings

3 讨论

3.1 PP333和TIBA对大叶黄杨根系氮吸收的影响

大叶黄杨在营养生长期内，同时喷施PP333和TIBA使得大叶黄杨植株根系有较高的氮素吸收和积累能力，其中最为显著的是提高了细根根系中全氮、硝态氮和游离氨基酸含量，表明PP333和TIBA对增强大叶黄杨苗木细根对氮的吸收能力有显著的协同促进作用，这与植物生长延缓剂的配合喷施能最大程度促进水稻 (Oryza sativaL.)[20]、杨梅(Myrica rubraSie b. et Zuca)[13]、花卉植物[21]根系对全氮、硝态氮的吸收等的研究结果相一致。

PP333和TIBA促进细根含氮化合物含量的途径主要通过对根系的影响实现：1) 植株内源激素GA3类抑制根系形成和生长[10-11]，而PP333能够抑制GA3的合成，从而促进了根系生长；TIBA则通过促进植株内ETH的形成，并在ETH与IAA协调控制作用下，起到促进植物侧根形成的作用[22-23]；2) 植物生长延缓剂通过抑制新梢生长使植株矮化，使得地上部的营养消耗显著降低，根部ABA含量增加，促进地上部积累的同化物向下运输，从而有利于根系生长和根系活力的提升[24]。并且，植物生长延缓剂对细根的作用效果显著优于中根，粗根作用效果则不显著，导致大量细根增生，显著增加吸收面积，因此在PP333、TIBA及两者的交互作用下，促进了细根根系发达、根表面积增大，显著增加了根系与土壤养分的接触面积，通过截获作用吸收更多的氮素营养而另一方面提高的根系活力又为植物根系吸收养分提供了充足的能量，从而促进根系对其高效吸收[25-26]。良好的根系形态发育增加了根系对氮素的接触面积，生理功能的变化又影响了氮素营养向根部的迁移及根对其的获取，从而显著提升细根根系对全氮、硝态氮的吸收[27]。

表8 PP333、TIBA及两者的交互作用对大叶黄杨光合色素含量影响的方差分析Table 8 ANOVA analysis on the effects of PP333 and TIBA on photosynthetic pigment content of B. megistophylla seedlings

表9 PP333和TIBA的交互作用对大叶黄杨光合色素含量的影响Table 9 Interactive effects of PP333 and TIBA on photosynthetic pigment content of B. megistophylla seedlings

3.2 PP333和TIBA对叶片中氮分配的影响

叶片氮存在的主要形式为蛋白质 (化学不溶蛋白和可溶性蛋白)，其他的氮以游离氨基酸、硝态氮(NO3-)[28]等形式存在。游离氨基酸是合成蛋白质的原料，硝态氮是合成其他有机氮的原料，可以调节其他含氮物质的量。

PP333和TIBA及其交互作用对叶片全氮有显著的促进作用，这与张红娜等对妃子笑荔枝 (Litchi chinensisSonn.)[29]、王丽特等对烟草 (Nicotiana tabacumL.)[30]和Sara等对水曲柳 (Fraxinus mandshuricaRupr.)[31]的研究一致。Matsoukis 等[5]研究表明，植株在植物生长延缓剂喷施处理下，生长受到抑制，叶面积指数下降、叶厚增加，因此“浓缩效应”是导致相对含量上升的原因之一，这也是大叶黄杨叶片在逆境条件下作出的反应。但在Huett等关于桃树 (Amygdalus persicaL.)[32]和郑涛等关于漳州水仙(Narcissus tazettavar.chinensis Roem.)[33]的试验中，植物生长延缓剂的喷施降低了叶片氮含量，与本文结果不一致，表明不同植物种类叶片氮代谢对植物生长延缓剂的响应机制不同。

叶片是最主要的硝态氮累积和同化器官，促进叶片营养体硝态氮的再利用，有利于改善植株生长期的氮素营养状况，提高氮素利用效率。本研究中，高浓度PP333能够促进叶片硝态氮含量的提升，这可能是由于PP333促进了全氮叶片的分配，因此合成的硝态氮含量随之增高；也可能是由于在PP333处理下，硝酸还原酶活性显著提升[34]，而在生长期的叶片中硝酸还原酶与硝态氮含量呈正相关关系[35]，因此硝态氮有所积累。然而，PP333中低浓度、TIBA各个浓度以及PP333和TIBA交互作用，对硝态氮含量均无显著变化，这与TIBA在一定程度上抑制植株中NO3-的转运基因AtNRT1.1的基因表达量，并导致NO3-转运蛋白合成受阻[36]，进而抑制了植物根系对NO3-的跨膜主动运输能力有关。PP333、TIBA及其交互作用均能够显著提升叶片内光合色素含量。研究表明，PP333、TIBA等植物生长延缓剂对植株进行叶面喷施处理，均能够不同程度地提高核桃 (Juglans regiaL.)[37]、毛竹[Phyllostachys heterocycla(Carr.) Mitford cv. Pubescens][38]等经济作物，小麦 (Triticum aestivumL.)、马铃薯(Solanum tuberosumL.)[39]等农作物，麻疯树 (Jatropha carcasL.) 等乔木[5,40]和草坪草叶片的光合色素含量，与本试验结果一致。这可能是在PP333和TIBA处理下，植株新梢生长受到抑制，叶片面积显著减小、叶厚增加，导致叶绿素含量相对增加；另一方面，植物生长延缓剂能够调节植物营养生长和生殖生长之间的关系，并通过抑制营养生长而调节营养物质在叶片中的分配，从而为叶绿素合成提供了条件。

3.3 大叶黄杨氮分配机制对PP333和TIBA的响应

本试验中，PP333、TIBA及其交互作用均促进了根系对氮的吸收和氮在叶片中的分配，然而PP333与TIBA对绿蓠植物具有延缓生长的作用[6-9]，这表明根系所吸收的氮素营养并未用于植株轴向生长，究其原因是植物生长延缓剂促进植物分蘖，增加茎的径向生长和叶厚。刘梅等[41]研究表明，同一氮素水平下，根系呼吸速率和氮素积累量呈显著线性负相关；胡凤琴等[42]也通过研究证实了单个根 (构件) 的生长发育与其吸收的养分收益和自身建造、维持的消耗有关。因此，大叶黄杨根系在PP333、TIBA及其交互作用下所吸收的氮可能用于三个部分消耗：根系的生长消耗、根系呼吸消耗以及地上部径向生长消耗[43]。氮在植物叶片的代谢过程中，通常有超过半数的氮会分配到叶绿体中参与光合作用，PP333、TIBA均促进更多的氮形成光合色素和可溶性蛋白，这两种形式的氮参与叶片的光合作用[44]，另外缩小的叶面积和降低的新梢生长量改善了叶片光照和通风条件，促进对光能的捕捉和光合产物的生成，光合产物有利于植物生长。然而，PP333和TIBA对大叶黄杨株高的抑制和对叶面积的减少改变了营养物质(包括光合产生的有机养分) 的运输路践，促进了分蘖增加[45]和植株斜向平伸；另一方面，在PP333和TIBA作用下，根系的建成需要消耗更多营养，从而促进光合产物的向下运输。综上，这是导致在PP333和TIBA作用下，地下部分所吸收的氮素营养和分配给叶片的氮均增多，植株生长却减缓的重要原因。氮在植物内的分配在一定程度反映其在不同环境下所采取的对策，即植物生长延缓剂对植株轴向生长形成抑制作用，又同时促进其根系发达，根系对于氮素营养的需求增多，因而显著提升了根系对氮素的吸收，同时促进了叶片光合产物的增加及其向下运输，从而增加地下部的生物量，生物量向资源受限制的资源方向分配，符合地上、地下的生物量分配的功能平衡原理[46]。

PP333对根系氮的吸收能力以及叶片不同形态氮含量的促进效果均优于TIBA，原因可能是：PP333抑制IAA的生物合成，从而促进其分解，然而TIBA只是抑制IAA的极性运输[12]，不影响它的生物合成；PP333显著抑制GA3的生物合成，而TIBA对其没有影响；PP333抑制细胞分裂，TIBA则促进细胞分裂；PP333主要是通过木质部向上运输，并不能通过韧皮部向下运输[47]。然而本研究关于PP333、TIBA对大叶黄杨根系氮吸收和叶片氮分配的具体影响途径讨论尚浅，缺乏具体的生理生化过程和物质调整的试验支撑，因此，在下一步的研究中应当从分子机理方面深入研究其作用途径。

4 结论

PP333和TIBA交互效应对大叶黄杨根系氮吸收和叶片氮代谢存在显著影响，其中对细根根系的全氮、硝态氮、游离氨基酸含量和叶片全氮、可溶性蛋白含量、光合色素含量提升效果最为显著，这验证了两种植物生长延缓剂配合喷施的必要性。PP333、TIBA的主效应中，随着PP333浓度上升，细根和中根根系氮以及不同形态氮含量、叶片氮及不同形态氮含量显著增加，仅在高浓度TIBA处理时细根根系氮吸收能力和叶片可溶性蛋白、全氮含量提升效果显著。除此之外，PP333相对于TIBA更能影响大叶黄杨苗木氮的生理代谢过程，且均在高浓度时影响最为显著。根据大叶黄杨根与叶对氮素的吸收和分配机制对多效唑与三碘苯甲酸的交互效应和主效应的总体响应规律，在生产应用与园林绿化维护中，80 mg/L PP333+100 mg/L TIBA配合喷施对促进大叶黄杨细根氮代谢的生理进程效果最优，并最为显著地增强叶色浓绿效果，优化景观价值，对大叶黄杨单施80 mg/L PP333则是最为经济地促进根系氮吸收和叶片氮分配的喷施处理。