油茶籽美拉德反应产物及其抗氧化能力

杨 楠 罗 凡 费学谦 钟海雁

(1. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400；2. 中南林业科技大学食品学院，湖南 长沙 410004)

美拉德反应(maillard reaction，MR)是食品中的还原糖与氨基酸之间发生的非酶褐变反应[1]，该反应会产生美拉德反应产物(maillard reaction products，MRPs)，其中包括早期的挥发性化合物，中间产物和大分子量的聚合物[2]。美拉德反应不仅会改善食品的色泽和风味，也会产生抗氧化性物质[3]。

Durmaz等[4]研究了焙烤对杏仁油氧化稳定性和抗氧化能力的影响，结果表明：180 ℃下，随着焙烤时间延长，杏仁油氧化稳定性和抗氧化能力呈增强趋势，得出可以通过适当的烘烤来改善油性坚果和种子的保质期。陈海光等[5]研究了模式美拉德体系产物对油脂抗氧化性能的影响，结果表明制得的美拉德反应产物向油脂中添加1%，测得油脂的抗氧化性最好。李志晓[6]研究了加工过程对油茶籽油微量营养成分和抗氧化性的影响，结果表明，130 ℃下发生美拉德反应的热榨油茶籽油对DPPH、ABTS、ORAC和FRAP 4种自由基的清除能力最强，抗氧化性最强。

油茶籽在生产和压榨过程中会经过剥壳、破碎、蒸炒[7]等高温工艺，具有产生美拉德反应的温度条件。油茶籽油中含有氨基酸和还原糖等营养成分[8]，因此具有发生美拉德反应的底物。本试验拟对油茶籽油中美拉德反应发生的温度条件，美拉德反应发生的指标及其产物含量与抗氧化性进行探索，以期研究油茶籽油在加工过程中物化特性的变化规律，为优化油茶籽油加工工艺以及油茶籽油营养品质及抗氧化性的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器

自动液压榨油机：6YY-190型，洛阳金厦液压机械有限公司；

紫外分光光度计：UV-2550型，日本岛津公司；

电子天平：S-114型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

离心机：Avanti J-E型，美国贝克曼库尔特公司；

分光测色计：CM-3600A型，柯尼卡美能达(中国)投资有限公司；

液相色谱仪：LC-10AT型，日本岛津公司；

紫外检测器：SPD-10A型，日本岛津公司。

1.2 样品与试剂

葡萄糖标准品：纯度98%，上海源叶生物科技有限公司；

2，2-联苯基-1-苦基肼基：纯度96%，美国Sigma-Aldrich公司；

羟甲基糠醛(HMF)：纯度98%，美国Sigma-Aldrich公司；

3-脱氧奥苏糖(3-DG)：纯度75%，加拿大Toronto Research Chemicals 公司；

乙二醛(GO)：纯度60%，加拿大Toronto Research Chemicals 公司；

丙酮醛溶液(MGO)：纯度98%，上海麦克林生化科技有限公司；

β-胡萝卜素：纯度96%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

亚油酸(纯度95%)、甲醇：HPLC级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

吐温-20：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

其他试剂均为分析纯；

试验用水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理与提取 选取新鲜成熟的浙江省普通油茶籽经干燥后分别经过30，60，90，120，150 ℃烘箱加热处理0，20，40，60 min后分别液压压榨得到油茶籽油，冷藏备用，将油茶籽饼粕粉碎、浸提、干燥后冷藏备用。美拉德反应产物提取：称取5 g的油茶籽油，并用甲醇萃取3次后定容至10 mL，取上清液，冷藏备用。

1.3.2 氧化稳定时间的测定 按GB/T 21121—2007执行。

1.3.3 水分、褐度、色值的测定

(1) 水分测定：按GB 5009.3—2016执行。

(2) 褐度的测定：取1 g油茶籽油，加入50%乙醇20 mL，在高速均质机作用下，冰浴中提取10 min。提取液于4 ℃、10 000×g离心10 min，过滤脱脂，收集滤液。分别在294 nm处测定美拉德反应产物的紫外吸光度和420 nm处测定美拉德反应产物的吸光值[9]。

(3) 色值的测定：采用投射模式，光路长度为10 mm，测量面尺寸为55 mm×57 mm的光学清洁玻璃制成的比色皿[10]。在仪器校正时，以去离子水作为校正标尺。校正完毕后，取1.3.1中压榨油20 mL倒入比色皿中，进行测定。

1.3.4 美拉德反应产物测定 采用高效液相色谱法。检测条件：流动相A为0.1%冰醋酸溶液，流动相B为甲醇；流速0.7 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；羟甲基糠醛检测波长280 nm；二羰基化合物检测波长314 nm；色谱柱型号ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测器为SPD紫外检测器；液相色谱洗脱程序如表1、2所示[11]。

表1 羟甲基糠醛的液相色谱洗脱程序Table 1 Liquid chromatographic elution procedure for hydroxymethylfurfural

表2 二羰基化合物的液相色谱洗脱程序Table 2 Liquid chromatographic elution procedure for dicarbonyl compounds

1.3.5 美拉德反应产物的抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除率测定：DPPH法[12]。按式(1) 计算DPPH自由基清除活性。

(1)

式中：

DPPH——自由基清除率，%；

A0——未加MRPS时DPPH溶液的吸光度；

A1——MRPS反应一定时间后DPPH溶液的吸光度；

A2——美拉德反应产物的吸光度。

(2)β-胡萝卜素的测定：亚油酸法[13]。按式(2)计算油茶籽油中抗氧化活性系数(the percent antioxidant activity，AA)。

(2)

式中：

AA——抗氧化活性系数，%。

1.4 数据处理

各项指标重复测定3 次，运用Excel、SPSS进行数据处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 油茶籽油氧化稳定性

油茶籽经过不同热处理后其压榨油的氧化稳定时间如图1所示。

从图1可以看出，压榨油茶籽油的氧化稳定时间随加热时间的延长呈先增大后趋于平稳的变化规律，在加热前期(20 min)，氧化稳定时间上升最显著，分别比加热前增加了2.10，4.46，4.93，5.20，6.17倍；加热中期(20～40 min)是氧化稳定时间缓慢变化期。在所考察的加热温度范围内，随加热温度的增加油茶籽油的氧化稳定性增强，其中150 ℃加热60 min 时，油茶籽油的氧化稳定时间最长。得出适当加热处理可以提高油茶籽油的氧化稳定性，与Vaidya[14]的研究结果类似。美拉德反应产物是提高油茶籽油氧化稳定性的主要因素，此外还可能有其他物质，如茶皂素、多酚、多糖、甾醇、VE等天然抗氧化成分提高了油茶籽油的氧化稳定性。

图1 热处理后压榨油茶籽油氧化稳定时间的变化

Figure 1 Changes in oxidation stabilization time of pressed oil seed oil after heat treatment

2.2 美拉德反应指标

2.2.1 水分 含水量也是研究美拉德反应进程的一个指标，油茶籽油加热前后水分变化如图2所示。

图2 美拉德产物水分的变化Figure 2 Changes in the moisture of Maillard products

从图2可以看出，经过不同温度和时间的加热可以降低油茶籽油的水分，在加热初期(20 min)，不同加热温度油茶籽油中水分的变化趋势相同；经SPSS分析得知，温度对油茶籽油水分有极显著影响，但时间对后者影响不显著；当在30，60，90，120，150 ℃下加热1 h后，油茶籽油中的水分分别降至 0.05%，0.08%，0.04%，0.05%，0.04%。因此油茶籽经过加热处理后其水分含量降低，可能会提高茶油的抗氧化性[15]。

2.2.2 褐度 美拉德反应中间产物主要是酮类及醛类物质，此类物质在294 nm处具有特征吸收峰[16]。本研究选取了0，20，40，60 min 4个反应时间，在294 nm测定油茶籽油美拉德反应中间产物来探讨加热时间对其形成的影响，结果见图3。

美拉德反应后期产物主要是一类棕褐色的、结构复杂的大分子化合物，油茶籽油美拉德产物在420 nm处的吸光值可以作为美拉德反应程度的指标[17]。在420 nm测定油茶籽油美拉德反应最终产物来探讨加热时间对其形成的影响，结果见图4。

图3 美拉德反应中间产物的变化Figure 3 Changes of the Maillard reaction intermediates

图4 美拉德反应最终产物的变化Figure 4 Changes of the final product of the Maillard reaction

试验结果表明，经加热处理后油茶籽的吸光度明显增加，其中较为明显的是120，150 ℃。随着加热时间的延长，油茶籽油美拉德反应产物在420 nm下的吸光度逐渐增加，溶液颜色加深，表明形成了褐色的聚合体——类黑精。随着美拉德反应时间的延长，产物的抗氧化能力也显著增强[18]。美拉德反应产生中间产物如酮类物质和醛类物质与最终产物如类黑素均能提高油茶籽油的抗氧化性。

2.2.3 色值 美拉德反应产物并非单一物质，而是十分复杂的物质体系，所以单一的波长并不能完全反应美拉德反应产物的真实颜色。本研究通过色差计测定反应体系的颜色变化[19](表3)，以期能全面反映美拉德反应不同阶段产物的色泽指标。

从表3可以看出，随着反应时间的延长L*值、b*值先增大后减少，a*值先减小后增大。随着加热时间的延长，油茶籽油颜色逐渐加深，在30，60，90 ℃时40 min之前变化的不是特别明显，90 ℃在40 min后颜色急剧加深尤其是在150 ℃加热后颜色比较深。结果表明，加热温度会导致油茶籽油颜色的变化，温度越高颜色越深；加热时间也会影响油脂颜色变化，但没有温度影响明显。因为油茶籽油中的磷脂，以及可能混入的蛋白和淀粉均会影响油茶籽油的色泽，其中磷脂通过加热容易变黑，从而加深油茶籽油的颜色。

表3 美拉德产物色值的变化Table 3 Changes in the color value of Maillard products

2.3 美拉德反应产物及其抗氧化性

2.3.1 美拉德产物含量 在美拉德反应的中期反应阶段形成众多活性中间体，如羟甲基糠醛[20]、葡萄糖醛酮[21]、3-脱氧奥苏糖、还原酮类等。美拉德反应的中间产物二羰基化合物具有很强的抗氧化性，目前已经发现的二羰基化合物的种类很多，本试验以3种最常见的二羰基化合物(3-脱氧奥苏糖、乙二醛、丙酮醛)为研究对象。油茶籽油美拉德产物丙酮醛含量如图5所示。

图5 美拉德产物丙酮醛含量Figure 5 Maillard product pyruvic aldehyde content

试验结果表明，随着加热时间的延长，120，150 ℃下丙酮醛的含量呈先增加后趋于降低，丙酮醛含量降低是因为在加热20 min后转化成了下一阶段的美拉德产物；30，60，90 ℃ 下丙酮醛的含量呈先增加后趋于平缓，丙酮醛含量趋于平稳说明90 ℃以下未达到转化为下一阶段美拉德产物的温度。丙酮醛含量在加热中期(40 min)之前随着温度的升高而增加，120，150 ℃在加热到20 min时含量最多达到0.701，0.760 μg/g，分别是加热前的3.08，3.35倍。丙酮醛含量与氧化稳定时间结合分析发现，其含量变化与氧化稳定时间变化规律相似；与抗氧化活性系数结合分析，发现在30 ℃下，线性相关性最好R2=0.766 3。

油茶籽油中美拉德产物乙二醛、3-脱氧奥苏糖含量见表4。

表4 美拉德产物乙二醛、3-脱氧奥苏糖含量†Table 4 Maillard product glyoxal, 3-deoxyosurose content

† “—”为小于最小检出限。

在150 ℃加热60 min时油茶籽油中开始检测出乙二醛和3-脱氧奥苏糖，含量分别为7.030，1.114 μg/g。而且此时的氧化稳定时间也是最高的。

2.3.2 美拉德反应产物抗氧化性 DPPH自由基清除力可以用于反映物质的抗氧化性。加热前后油茶籽中美拉德反应产物清除DPPH自由基的能力见图6。

由图6可知，不同反应温度和反应时间提取的美拉德反应产物都具有一定的清除DPPH自由基作用，并且清除自由基能力随着反应时间延长先降低后增加。加热40～60 min时美拉德产物的自由基清除率显著增加，在150 ℃下反应60 min时达到最高为95.27%。与Sahin等[22]的研究结果相似，从而证明适当热处理可以提高抗氧化性。在加热0～40 min 时，清除自由基能力下降，可能是加热使油茶籽油中一些天然抗氧化物质分解。而在40 min后其清除自由基能力增强，就是因为发生了美拉德反应，其产物具有清除自由基能力。

图6 美拉德产物清除DPPH自由基能力的变化Figure 6 Maillard products remove DPPH·Capacity changes

由图7可知，油茶籽油美拉德产物的抗氧化活性随着加热时间的延长逐渐增强。其中150 ℃下美拉德产物的抗氧化能力最强，40～60 min时清除自由基能力显著增加，在反应60 min时达到最高为64.17%。其抗氧化能力增强主要是因为在150 ℃下加热60 min产生了3-脱氧奥苏糖、丙酮醛、乙二醛等美拉德产物。综上得出，油茶籽油中3-脱氧奥苏糖、丙酮醛、乙二醛等美拉德产物能提高其抗氧化能力。

图7 抗氧化活性系数Figure 7 Antioxidant activity coefficient

3 结论

本研究通过测量不同加热温度及反应时间处理油茶籽油美拉德反应的产物，发现其水分含量随着时间的延长而减少；而颜色随着加热时间延长而加深；相同温度下加热时间越长，油茶籽油的氧化稳定性越好。采用高效液相色谱测定油茶籽油中的美拉德产物，发现加热前后油茶籽油中未检测到羟甲基糠醛；随着加热时间的延长，丙酮醛的含量呈先增加后趋于降低，150 ℃加热到20 min时含量最多，达到0.76 μg/g，是加热前的3.35倍。在150 ℃ 加热60 min时油茶籽油中开始检测出3-脱氧奥苏糖和乙二醛，含量分别为1.114，7.030 μg/g。油茶籽油在150 ℃加热60 min时产生美拉德产物最多且具有明显抗氧化能力， DPPH自由基清除率为95.27%；抗氧化活性系数为64.17%。

综上，油茶籽发生美拉德反应后其产物是具有一定抗氧化性，可能延长油茶籽油的氧化稳定性。在油茶籽油中起抗氧化作用的美拉德产物可能是乙二醛、3-脱氧奥苏糖和丙酮醛等。美拉德反应是一个复杂的反应体系，MRPs的具体组成及对其的抗氧化物质和抗氧化机理有待进一步研究。