电针对SAMP8小鼠学习记忆与海马神经元NMDA受体表达的影响

骆雍阳　蒋艺燕　杨文丹　赵恩聪　李斐斐　许茜　钱长晖　董卫国

摘要：目的 观察电针“百会”“大椎”“肾俞”对SAMP8小鼠学习记忆与海马神经元NMDA受体NR2A和NR2B表达的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病的机制。方法 6月龄SAMP8小鼠24只，随机分为模型组和电针组，同龄正常老化SAMR1小鼠12只为对照组。电针组电针“百会”“大椎”“肾俞”30 d。Morris水迷宫实验检测小鼠学习记忆能力，免疫组化染色和Western blot检测海马神经元NR2A和NR2B的表达。结果 与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01），原平台象限停留时间明显缩短（P<0.01），跨越原平台次数明显减少（P<0.01），海马神经元NR2A相对表达量明显升高（P<0.01），NR2B相对表达量明显下降（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），原平台象限停留时间明显延长（P<0.01），跨越原平台次数明显增加（P<0.05），海马神经元NR2A相对表达量明显下降（P<0.05），NR2B相对表达量明显升高（P<0.01）。结论 电针能改善SAMP8小鼠的学习记忆能力，其作用机制可能与电针抑制海马神经元NMDA受体NR2A的表达和促进NMDA受体NR2B的表达有关。

关键词：阿尔茨海默病；电针；NMDA受体；SAMP8小鼠

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）03-0051-05

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture （EA） at acupoints of Baihui （GV20）， Dazhui （GV14） and Shenshu （BL23） on cognitive function and neurons NMDA receptors NR2A and NR2B in the hippocampus in SAMP8 mice； To explore the mechanism of EA in the treatment of Alzheimer disease （AD）. Methods Totally 24 six-month-old SAMP8 mice were randomly divided into model group （n=12） and EA group （n=12）， and the same age SAMR1 mice were as control group （n=12）. The EA group accepted EA at Baihui， Dazhui and Shenshu for 30 days. Morris water maze was used to detect the learning and memory ability of mice. Immunohistochemical staining and Western blot were used to observe the expressions of NR2A and NR2B in hippocampal neurons. Results Compared with the control group， escape latency increased （P<0.01）， the time staying in the quadrant of the platform decreased （P<0.01）， as well as the number passing the original platform （P<0.01）， and the relative expression of NR2A increased （P<0.01） and the relative expression of NR2B （P<0.01） in hippocampus decreased in the model group. Compared with the model group， escape latency decreased （P<0.05）， the time staying in the quadrant of the platform increased （P<0.01）， as well as the number passing the original platform （P<0.05）， and the relative expression of NR2A decreased （P<0.05） and the relative expression of NR2B increased （P<0.01） in hippocampus in EA group. Conclusion EA can improve the learning and memory ability of SAMP8 mice， and its mechanism may be that the EA can inhibit the expression of neurons NMDA receptor NR2A and increase the expression of NR2B in hippocampus.

Keywords： Alzheimer disease； electroacupuncture； NMDA receptor； SAMP8 mice

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是以进行性认知功能障碍和记忆损害为主的中枢神经系统退行性疾病。其主要病理特征是细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积形成的老年斑、细胞内高度磷酸化tau蛋白形成的神经纤维缠结以及神经元和突触数量的减少。有研究报道，AD早期可见突触功能障碍和突触丢失，提高突触可塑性能改善认知功能障碍[1-2]。N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）是一种离子通道型谷氨酸受体，在突触可塑性的调控中起非常重要的作用，参與学习和记忆的产生和维持过程[3] 。这与NMDA受体的功能单位N-甲基-D-天冬氨酸受体2A（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2A，NR2A）亚基和N-甲基-D-天冬氨酸受体2B（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）亚基密切相关。我们前期研究表明，电针治疗能改善快速老化模型小鼠亚系SAMP8小鼠学习记忆能力和突触功能[4-6]。SAMP8小鼠目前被认为是一种较为完善的AD模型[7] ，已广泛应用于AD的研究[8]。本实验通过电针SAMP8小鼠“百会”“大椎”“肾俞”，观察电针对SAMP8小鼠海马神经元NMDA受体NR2A和NR2B表达的影响，探讨电针改善SAMP8小鼠学习记忆能力的可能机制，为电针防治AD的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

6月龄抗快速老化小鼠亚系SAMR1小鼠12只，雄性，体质量20～25 g，北京大学医学部实验动物中心提供，实验动物质量合格证号SCXK（京）2011-0012，设为对照组；6月龄SAMP8小鼠24只，雄性，体质量20～25 g，采用随机数字表法将其分为模型组和电针组，每组12只，北京维华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物质量合格证号SCXK（京）2014-0004。饲养于福建中医药大学SPF级动物实验中心，实验前小鼠适应性喂养1个月，实验动物均在完全一致的生活环境和饮食条件下饲养，温度（23±1）℃，相对湿度（55±15）%，12 h光照，自由摄食饮水。实验过程严格按国际动物保护及使用指南进行。

1.2 主要试剂与仪器

兔多克隆抗体NR2A（批号ab203197），Abcam；兔多克隆抗体NR2B（批号21920-1-AP），Proteintech；β-actin（批号20536-1-AP），Proteintech；生物素标记的羊抗兔IgG、DAB试剂盒，福州迈新生物工程有限公司；特超敏ECL化学发光试剂盒，碧云天生物技术公司；Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，Bio-Rad图像分析系统。G6805-Ⅰ电针治疗仪，青岛鑫升实业有限公司；0.25 mm×15 mm华佗牌无菌针灸针，苏州医疗用品厂有限公司；Morris水迷宫系统，中国医学科学院药物研究所；电镜CCD相机-图像采集分析系统，德国Soft-Imaging-System公司。

1.3 干预

电针组采用自制网兜固定小鼠，选择“百会”“大椎”“肾俞”进行电针治疗，参照《实验针灸学》[9]取穴、定位：“百会”位于小鼠顶骨的正中，“大椎”位于背部正中（第7颈椎与第1胸椎间），“肾俞”位于第2腰椎下两旁。具体操作方法：“百会”向前斜刺2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“肾俞”稍向内斜刺3～4 mm，其中“大椎”“肾俞”加电针，“肾俞”双侧交替进行。进针后不进行手法刺激，连接电针治疗仪，连续波，频率2 Hz，电流强度以引起小鼠后肢肌肉轻微颤动而不嘶叫为宜。每日1次，每次20 min，8 d为1个疗程，疗程间隔2 d，进行下1个疗程，共3个疗程。模型组和对照组不进行电针治疗，只进行与电针组相同方式、时间和程度的抓取和固定。

1.4 Morris水迷宫实验

采用Morris水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力，包括有定位航行实验和空间探索实验。电针治疗结束后开始进行定位航行实验。将平台置于第三象限，没于水下1 cm，每日上、下午各训练4次，将小鼠分别从4个入水点（各象限池壁中点）面向桶壁放入水中，记录小鼠爬上平台所需时间，即逃避潜伏期，如果90 s内未找到平台则将其引至平台并在平台停留10 s，记录逃避潜伏期为90 s，连续5 d。第6日撤掉平台，进行空间探索试验，将小鼠从第一象限池壁中点放入池中，自由游泳90 s后结束试验，记录小鼠在原平台象限停留的时间和跨越原始次数。

1.5 免疫组化染色检测

水迷宫实验测试结束后，每组取6只小鼠，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手术台上，剪开胸腔，暴露心脏，从心尖插入灌注针至左心室，同时剪开右心耳。快速注入37 ℃生理盐水80 mL，再注入4%多聚甲醛80 mL灌流固定。取全脑修块后立刻放入4%多聚甲醛内，4 ℃固定24～48 h。常规梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋。石蜡切片，厚约4 μm，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，将黏附脑组织载玻片置于柠檬酸修复液中，微波炉加热修复，降至室温。分别加入NR2A抗体和NR2B抗体，4 ℃湿盒孵育过夜。37 ℃复温1 h后加入生物素标记的羊抗兔IgG的二抗，DAB显色，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照。用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对海马CA1区NR2A及NR2B的图片进行分析，计算NR2A及NR2B的平均光密度（MOD）。

1.6 Western blot检测

每组取6只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，灌注针插入左心室，快速注入37 ℃生理盐水80 mL，快速断头取脑，在冰浴上分离出完整海马，存放于-80 ℃冰箱，称左侧海马湿重，加RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF，超声匀浆后，4 ℃、14 000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA法测上清液浓度。蛋白样品用6%SDS-PAGE于常温下以30 V、20 min，80 V、30 min，120 V、50 min进行电泳。电泳结束后，4 ℃、300 mA将蛋白质从SDS-PAGE转到PVDF膜上。转膜后用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭2 h，加入一抗（兔多克隆抗体NR2A，1∶200；兔多克隆抗体NR2B，1∶1500；抗小鼠β-actin，1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次×10 min；加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000），室温下摇动孵育1 h，TBST洗涤3次×10 min。避光将显影剂的底物A液和B液以1∶1混合后均匀覆盖至PVDF膜上，在凝胶成像系统中拍照、观察。目的条带采用 Bio-Rad图像分析软件进行光密度积分值分析，目的蛋白与β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，水迷宫定位航行实验结果进行重复测量方差分析，其他指标采用方差分析，组间比较采用两两比较，方差不齐时用Dunnett's t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验结果

定位航行实验：与对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），见表1。空间探索实验：与对照组比较，模型组小鼠原平台象限停留时间明显缩短（P<0.01），跨越原平台次数明显减少（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠原平台象限停留时间明显延长（P<0.01），跨越原平台次数增多（P<0.05）。见表2、图1。

2.2 免疫组化染色结果

与对照组比较，模型组小鼠NR2A平均光密度显著升高（P<0.01），NR2B平均光密度值显著降低（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠NR2A平均光密度显著降低（P<0.01），NR2B平均光密度值显著升高（P<0.01）。见表3、图2和图3。

2.3 Western blot检测结果

与对照组比较，模型组小鼠NR2A相对表达量显著升高（P<0.01），NR2B蛋白相对表达量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，电针组小鼠蛋白NR2A相对表达量降低（P<0.05），NR2B蛋白相对表达量显著升高（P<0.01）。见表4。

3 讨论

AD属中医学“呆证”“健忘”等范畴，其基本病机为肾衰髓虚，髓减脑消，神机失用。AD病位在脑，根据经络理论，“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑”（《难经·二十八难》），可见，督脉与脑密切相关，历代医家素有“病变在脑，首取督脉”之说。因此，从督脉调治AD越来越受到重视[10]。百会位于巅顶，其深处为脑之所在，具有醒脑开窍、安神益智的功效，是调节脑功能、治疗脑部疾病的要穴。大椎是手足六阳经的交会穴，为“诸阳之会”，总督一身之阳气，是升阳开窍、健脑调神的效穴。百会和大椎属督脉穴，两穴结合可使诸经通调，促进经气运行，濡养脑髓气血，促进阴阳平衡。《医学心悟》认为“肾主智，肾虚则智不足，故喜忘其前言”，唐容川《中西汇通医经精义》指出：“事物之所以不忘，赖此记性，记在何处，则在肾精。益肾生精，化为髓，而藏之于脑中。”肾藏精生髓，肾俞为肾的背俞穴，肾中精气汇集于此，具有补益肾气、调节督脉之功；肾经与督脉相连，入髓连络脑海。根据相关文献[11]和我们前期研究[5-6，12]，本实验应用“益肾调督”法，选取“百会”“大椎”和“肾俞”为治疗腧穴。

針灸在防治衰老性疾病中发挥着巨大优势，治疗AD受到越来越多的重视与关注[13]。研究发现，电针“肾俞”“百会”能减少海马Aβ沉积，降低tau蛋白的过度磷酸化，从而改善AD模型大鼠认知损伤；益肾调督针灸法可能通过减少或抑制AD大鼠血清内Aβ水平，降低大鼠海马CA1区淀粉样前体蛋白的表达[11] 。这与我们前期的研究[5-6，12]相一致。突触是神经元传递信息的主要结构，是学习与记忆形成的重要形态学和功能学基础[14]。研究表明，电针治疗明显增加突触面积与体积，提高突触素表达水平[15]，增加CA1区神经元的突触数量，改善突触超微结构[16]；电针“百会”“肾俞”能提升AD大鼠海马CA1区SYN、PSD-95蛋白水平，促进突触可塑性的增强[17]。改善突触功能被认为是减轻AD认知损伤的有效治疗方式[18]。

NMDA受体是一种重要的离子型谷氨酸能受体，广泛分布于中枢神经系统，尤其海马部位[19]。NMDA受体包括3种亚单位，分别是NR1、NR2（NR2A～NR2D）和NR3（NR3a、NR3b）[20]。NMDA受体在突触可塑性的调控中起重要作用，参与学习和记忆的产生和维持过程[21]，这与NMDA受体的功能单位NR2A和NR2B亚基密切相关。研究表明，NR2A缺失的小鼠快速获得性空间工作记忆发生了障碍，而上调NR2A的表达能损害空间工作记忆能力；NR2A基因突变小鼠表现为在新环境中自发运动增强和潜在学习能力降低[22]。NR2B亚基表达减少的大鼠表现出的学习记忆能力较正常大鼠下降，而给予上调NR2B表达的药物可增强长时程作用，改善大鼠学习记忆能力[23]。本实验通过免疫组化和免疫印记检测显示，电针组NR2A蛋白表达明显低于模型组，NR2B蛋白表达明显高于模型组。邱文兴等[24]发现，电针治疗能提高NR2B mRNA的表达，改善学习记忆能力。这与本实验结果相一致。

我们前期研究表明，电针SAMP8小鼠“百会”“大椎”“肾俞”可提高海马CA1区神经元突触蛋白的表达，改善突触的超微结构[6]。因此，结合本实验结果，我们认为电针改善AD小鼠学习记忆能力的机制可能与电针抑制海马神经元NR2A的表达和促进NR2B的表达相关。但是本实验未设置非穴位组，缺少与非穴位治疗的对比，将在今后实验中进一步完善。

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（收稿日期：2018-09-06）

（修回日期：2018-09-30；编辑：华强）