循环肿瘤细胞的分离检测技术及其研究进展

郭晗晗， 鄢树枫(综述)， 陈 卓(审校)

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)自发现以来，因其在肿瘤转移过程中扮演着重要的角色已成为当前肿瘤学的研究热点。作为一种“液体活检”，通过随时获取CTC进行检测，可用于指导临床制定治疗方案、判断患者预后、评价疗效等，在肿瘤患者的实时个体化医疗中具有独特优势。但是,由于CTC在血液中的数量稀少，对比每毫升血液存在的500亿个红细胞和上亿个白细胞而言，CTC的数目只能以个位数计，这对其检测造成了极大的挑战。因此，发展稳定、灵敏及特异性高的检测方法是开展CTC相关研究的关键。近年来，多种分离检测CTC的设备取得了快速发展，为CTC的相关研究奠定了基础。CTC的检测主要基于其生物学特性(如标记蛋白的表达)或其物理特性(如大小、可变形性及电荷等)，笔者将针对目前CTC的分离检测技术进行综述。

1 基于CTC生物学特性的检测方法

1.1基于CTC表面特异性蛋白质 基于生物学特性检测CTC的方法大多是通过识别CTC表面特异性表达的蛋白质，最常用的方法之一是基于上皮特异性抗体表皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)进行检测。如2004年强生子公司Veridex开发的Cell Search System是第一个也是唯一一个在美国、欧洲和中国均获得临床试验批准的CTC检测系统，基于CTC可同时表达EpCAM和细胞角蛋白(cytokeratins)8，18或19，但不表达白细胞标记蛋白CD45的特性[1]。Cell Search System利用结合了荧光染料的抗-EpCAM抗体磁性微粒，从血液样本中分离出表达EpCAM的细胞，并利用结合了荧光染料的抗-CD45、抗-细胞角蛋白以及细胞核染料DAPI对CTC进行进一步筛选识别。Yoo等为进一步提高对CTC的检测灵敏度，建立了SSDS方法，即将高密度的透明二氧化硅微珠表面与抗-EpCAM抗体结合，使CTC和微珠的复合体利用密度梯度离心与其他细胞有效分离[2]。该法对具有不同EpCAM表达水平的CTC具有良好的分离效果，尤其是对于低表达EpCAM的CTC细胞，比Cell Search System拥有更高的灵敏度。

大量研究表明，CTC具有高度异质化现象。CTC在血液中可以不同形式存在，并具有上皮-间质转化功能(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，即丧失上皮细胞特征，获得类似干细胞的表型[3]。因此，仅基于EpCAM进行CTC检测，可能丢失一些潜在的更重要的CTC亚型[4-5]。因此，除了EpCAM之外，选择其他CTC检测标记物，如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)[6]，以及针对携带EMT的CTC细胞的靶向标记物角蛋白、波形蛋白等是十分必要的，否则易出现假阳性结果，影响检测准确度。

1.2基于CTC表面特异性标记物 近年来，除了利用天然抗体检测CTC外，还出现了利用核酸适配子检测CTC的方法[7-8]。与天然抗体相比，核酸适配子不仅与CTC表面具有更强的亲和力和更高的特异性外，还有较高的稳定性和良好的合成再现性，以及便于进行化学修饰等优势，尤其在不明确特定细胞标记物的情况下，可通过体外过程直接构建细胞特异性核酸适配子[9]。

Zeng等建立了一种利用核酸适配子报告子检测CTC的方法，该报告子是由适配子和一对具有荧光猝灭作用的荧光分子组成。当适配子靶向细胞表面特异性标记物时，触发细胞内化作用，发生溶酶体降解，导致具有荧光猝灭作用的一对荧光分子分离，从而发出荧光信号，达到检测目的[9]。这个过程(一步法)在数分钟内就可以完成，克服了抗体介导的检测方法实验步骤多、耗费时间长等缺点。但单个适配子只能检测单一状态的CTC，限制了其在临床上的应用。Zhao等利用已有的适配子组的协同作用，建立了随机设计适配子混合物的方法，即通过硅纳米线基板嵌入式微流芯片，加强在非小细胞肺癌中对CTC的微分捕获(两步法)[10]。以上这些基于核酸适配子检测CTC的新方法，在理论上与传统的抗原-抗体免疫结合的检测方法相比，具有一定优势，但尚未得到临床上的验证。

1.3基于CTC基因表达 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)技术的应用，使对一些极为微量RNA样品的分析成为可能。基于CTC与血细胞基因表达的差异，可利用RT-PCR对CTC进行检测。该方法的关键在于找到合适的标记基因，从而将其表达水平与样品的肿瘤细胞数进行关联。一般来说，PCR产物有两种定量方法，即相对定量和绝对定量。绝对定量方法需建立目标基因的标准曲线，与实时定量PCR的记录进行对比；而相对定量方法仅需将参考基因(基本上是持家基因，如GAPDH，18S，RPLP0或B2M)与目标基因同时扩增即可。基本步骤如下：首先对样本预处理，如密度梯度离心等以富集CTC细胞；然后选择目的基因进行RT-PCR，如MGB1，CK-19，EGFR Ⅷ，hMAM等[11]；最后对检测结果进行分析，确定CTC的数量。

目前，不少实验室建立了多通道RT-PCR检测CTC的方法[12-13]。该方法只需极少量核酸就可同时检测多个目的基因。其中，Adna Test方法是利用免疫磁珠进行分离后，再通过多通道RT-PCR检测CTC，其检测限可达到2个CTC。借助该项技术，对转移性乳腺癌患者样本的检出率为69%；Liquid Bead Array方法则是将多通道RT-PCR结合液珠阵列检测CTC，可同时检测6个基因，既节省了时间，也减少了所需的样品量。以上这些利用RT-PCR检测CTC，因所需样品量少、灵敏性高等优点已受到广泛关注。但也由于所需样品量极少，附带出所得结果的统计学价值以及可重复性等方面的缺憾。

2 基于CTC物理特性的检测方法

由于CTC的异质化特性，使其具有不同表型。因此，仅仅基于细胞表面特异性标记物来进行检测会丢失某些其他表型的CTC[5,14]，使检测的灵敏度受限。而基于CTC的物理特性对其进行分离检测，可较大程度地获得更多不同亚型的CTC。

2.1基于CTC直径大小 某些CTC的直径大于血液中正常红细胞和白细胞，因此，利用聚碳酸酯微孔过滤器，即利用孔径为8 μm的过滤器过滤分离CTC，可让较小的红细胞和血细胞通过而有效截留CTC。之后出现了具有精确工程性能的CTC微型过滤器，但由于过滤器上的孔隙是随机产生的，孔隙之间排列不整齐，孔隙大小也不够均一，分离效果不是很理想。后来，通过优化微型过滤器，使其拥有精确的孔径和排列整齐的孔隙，明显提高了对CTC的分离效果[15]。使用离子束蚀刻聚碳酸酯膜也可形成具有均一过滤孔的材料，达到优化基于CTC尺寸的分离方法，如基于细胞大小的上皮肿瘤细胞分离设备(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)[16]。据报道，以聚对二甲苯膜为材料建立的一种3D微型过滤设备，可以捕获血液中CTC。此外，微流系统“屋脊式”结构具有良好的分离与血细胞尺寸不同的CTC的效果[17]。如螺旋微流设备能在短时间内处理大量样本[18]，甚至在混合细胞的实验中，也可达到至少85%的CTC检测率。

2.2基于CTC可变形性 研究发现，前列腺癌和直肠癌CTC的尺寸与白细胞有重叠。与白细胞相比，这些CTC表现出更高的核质比[19]。因此，可以基于细胞的可变形性来分离CTC和白细胞，进一步提高检测的灵敏性。如微流分离平台，这是基于细胞尺寸与变形性差异建立的平台，可以对血液中CTC进行分离，获得高纯度CTC，还可进行后续的系列操作，如细胞培养、荧光原位杂交、组织病理学分析等[15]。Park等报道，借助震荡流动使单个细胞通过锥形测微计时发生规模收缩而产生棘轮效应，可以让CTC、白细胞及红细胞产生不同的流动路径，从而在尺寸基本相同的情况下达到无标签分离血液中CTC的目的[20]。

2.3基于CTC表面粗糙黏附力 Chen等报道，由于肿瘤细胞和正常细胞对玻璃表面的黏附能力不同，可借助反应离子蚀刻(reactive ion etching，RIE)形成纳米粗糙表面，成功捕获不同类型肿瘤细胞[21]。

2.4基于CTC介电性质 基于不同类型细胞间的电介质差异，通过双向介电电泳进行CTC分离，如DEP-FFF法可成功分离多种类型的肿瘤细胞。Moon等将多孔分流(multi-orifice flow fractionation,MOFF)与介电电泳结合用于乳腺癌CTC的分离，获得了高分离效率[22]。Varadhachary等基于DEP-FFF分离方法，建立了商业化的微流平台ApoStreamTM[23]。该方法的缺点在于：细胞质和细胞膜的导电性在分离过程中会发生改变，因此需要弱化细胞间的相互作用来减小其影响。

3 集成设备检测平台

目前，对CTC的分离技术不仅要达到可灵敏地检测CTC，而且要继续对其药物耐受性及转移潜能进行分析。因此，结合多种CTC检测分离方法，建立集成设备是目前针对CTC分离检测的发展趋势。Tang等将微流系统和免疫磁性分离系统结合，将CTC的捕获效率提高到94%；同时，捕获的CTC可在倒置荧光显微镜下进行原位观察，有效减少了细胞损失，维持细胞活性高达93%[24]。此外，与免疫纳米磁珠分离后的CTC还可继续培养观察。Zhao等利用硅纳米基线板嵌入微流芯片，并结合适配子混合物对CTC进行分离[10]，这对表征CTC异质化方面具有潜在的临床应用价值。Adams等建立了多位一体的集成设备，可完成微型过滤器分离CTC、原位细胞培养、原位荧光杂交、组织病理学分析、H-E染色、光漂白以及复染等操作[15]。

4 结论与展望

笔者将近年来针对CTC的分离检测方法进展进行了归纳总结(表1)。随着CTC分离检测手段的快速发展，越来越多的证据已表明，CTC作为液体活检技术，在癌症的早期检测、转移复发风险评估(预后信息)、治疗靶标和耐药机制的确定、实时治疗的监测、患者的分层等多方面均有重要应用价值。但是，目前CTC作为肿瘤标记物进入临床检测还有一定困难。CTC分离检测技术进入临床应用，亟待解决的问题之一是要建立统一、规范化的评价标准。此外，由于CTC在蛋白质、RNA、基因组水平都携带了大量肿瘤部位的信息，CTC检测手段已不仅仅局限于检测，而是越来越侧重于捕获活的CTC细胞，通过其在细胞水平和分子水平上的表征，获得包括相关肿瘤转移与复发、药物耐受性等信息。未来，这一领域仍将是研究热点。

表1 循环肿瘤细胞分离检测方法