磷掺杂碳量子点的分离及其光学性能研究

雷 云， 黄丹丹， 林新华， 刘爱林

纳米碳量子点是一种以碳元素为主体的、具有荧光发射功能的碳球[1]。碳量子点因粒径差异可发射出不同颜色的荧光[2]，因此又称为荧光碳量子点[3]。荧光碳量子点被近红外光激发后，在近红外光谱范围内可显示荧光，可应用于体内纳米生物技术。与传统的有机染料和半导体量子点相比，荧光碳量子点因具有低细胞毒性、高光稳定性、良好的化学惰性和生物相容性等特点而被广泛应用于生物成像和光催化中[4-5]。在合成碳量子点的大部分方法中，所得产物均存在尺寸、形貌不均一的现象，甚至还包含许多合成中间体及未反应的原料[6]，为获得形貌均匀且尺寸分布窄的碳量子点就需要进行分离。因此，将产物分离纯化，从而扩大其在荧光探针及生物传感器中的应用具有重要的意义。荧光碳量子点的分离具有较大的可控性和灵活性，可以进行有目的地分离，既可依据碳量子点的尺寸，也可根据碳量子点的极性大小以及表面的电荷量进行分离，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法、毛细管电泳法、阴离子交换离子色谱法、反相高效液相色谱法、离心分离法[7-14]。本研究基于荧光碳量子点的极性大小，利用硅胶柱层析色谱对制备的磷掺杂碳量子点混合物进行分离，并对各组分的光学性能进行研究，为进一步获取高质量的荧光碳量子点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 膦甲酸钠(≥98%，上海阿达玛斯公司)；果糖(≥98.5%，美国GENVIEW公司)；硫酸奎宁(99.0%，上海阿拉丁公司)；乙酸乙酯及甲醇(上海泰坦科技股份有限公司)；浓硫酸(98%)及硅胶(200-300目)(上海国药集团化学试剂有限公司)。上述试剂如无特别说明，均为分析纯。

聚四氟高压反应釜(YZ-HR-25ML，北京岩征生物科技有限公司)；紫外可见分光光度计(UV-2450型，日本岛津公司)；荧光分光光度计(F-4600型，日本日立公司)；红外光谱仪(Nicolet 380，上海驭锘实业有限公司)；电子分析天平(BS110S，德国Sartorius公司)；台式高速冷冻离心机(Neofuge 23R，上海力新仪器有限公司)；鼓风干燥箱(BAO-80A，施都凯设备有限公司)；冷冻干燥器(FD-1-50，天津比朗实验仪器制造有限公司)；旋转蒸发仪(RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂)。

1.2方法

1.2.1磷掺杂碳量子点的制备 称取果糖1.8 g和膦甲酸钠1.1 g，加入10 mL去离子水，待样品完全溶解后，转移至聚四氟高压反应釜内，密封。置于烘箱内，于200 ℃下反应3 h后，关闭电源，自然冷却至室温。将反应结束的样品溶液转移至15 mL离心管，继续向反应釜内加入5 mL去离子水，充分搅拌沉淀后一并转移至离心管内，12 000 r/min离心10 min。取上清液，用0.22 μm的滤膜过滤，即得碳量子点溶液。将所得的碳量子点溶液冷冻干燥后用去离子水复溶成一定浓度的碳量子点溶液。

1.2.2磷掺杂碳量子点的分离 称取硅胶35.0 g于洁净的瓷盘上，并置于烘箱中活化，100 ℃恒温加热45 min，待活化完毕，降至室温取出。采用湿法装柱，以不同体积比的乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱剂，依次进行洗脱(溶剂比例依次为100∶0，80∶20，50∶50，20∶80，0∶100)，在洗脱过程中逐渐增加洗脱溶剂的极性，直至样品被全部洗脱。每个淋洗梯度依次收集12管洗脱液，每管体积约9 mL，共计收集60管，并按照流出顺序编号为1～60。收集的洗脱液分别转移至圆底烧瓶中，通过旋转蒸发浓缩至1～2 mL，并真空干燥得到荧光碳量子点固体产物，加入一定去离子水，配制成一定浓度的荧光碳量子点溶液。

2 结 果

2.1硅胶柱色谱分离条件的优化 实验采用乙酸乙酯-乙醇、乙醇-水、乙酸乙酯-甲醇3种不同的洗脱体系分离碳量子点。以乙酸乙酯-乙醇为洗脱体系，发现乙醇比例增大至50%时，样品才开始被洗脱。该洗脱体系流速慢，样品色带迁移速度缓慢，洗脱时间长，且乙醇比例增大至100%时，仍有部分样品未被洗脱。因此，改用洗脱能力大的乙醇-水为洗脱体系，当乙醇和水比例为100∶0时，碳量子点样品被大量洗脱；当二者比例为80∶20时，观察到两条明显色带；当二者比例为70∶30时，样品层几乎被全部洗脱，不利于样品收集制备。因此，改乙酸乙酯-甲醇体系作为洗脱体系，分别以100∶0，80∶20，50∶50，20∶80，0∶100的比例梯度依次淋洗硅胶柱。当乙酸乙酯含量为100%时，样品开始被洗脱；随着洗脱溶剂极性增大，硅胶柱陆续出现多条颜色深浅不同的色带；当比例为20∶80时，柱色谱中大量碳量子点样品被洗脱；当比例为0∶100时，样品层几乎被全部洗脱，收集流出液，测试每个组分的光学性能。

2.2不同洗脱条件下碳量子点荧光性能的考察 分别测定不同洗脱条件下分离获得的碳量子点组分的激发光谱和荧光光谱，不同洗脱组分的发光性质(包括激发波长和发射波长)见表1。可见相同洗脱条件下获得的组分的激发波长与荧光发射波长较为相近，如1～13号的激发波长为225～234 nm，发射波长为380～400 nm。同时依据相近的发光性质，将碳量子点组分分成三类(表1)。随着甲醇的比例增大至50%之后(组分编号32～60)，收集组分激发峰和发射峰基本未发生位移，且与未分离的碳量子点混合液的激发峰和发射峰位置一致(图1)，该部分碳量子点约占所收集溶液的一半。

2.3碳量子点的紫外光谱和荧光光谱表征 根据发光性质选取典型组分(编号分别为10，24，37，极性依次增大)进行光谱表征。3个组分与掺磷碳量子点混合液的紫外-可见吸收光谱图见图2A，可见在240～260 nm均有吸收峰。不同组分荧光碳量子点的归一化荧光光谱图见图2B，其中插图为未分离的碳量子点与3个组分在365 nm波长的紫外灯下的光学图片，未分离的碳量子点原液呈现微弱的淡蓝色荧光，经分离得到的3个荧光碳量子点发射波长分别为400，432，453 nm，在紫外灯下分别呈现蓝色、黄色、黄绿色荧光。

表1不同洗脱组分的激发波长和发射波长

Tab1The maximum excitation and emission wavelengths of the different carbon quantum dots

光学参数组分编号1～1314～3132～60λex (nm)225～234321～330349～358λem (nm)380～400421～433450～461

λex：激发波长；λem：发射波长.

λex：激发波长；λem：发射波长.图1 未分离纯化的荧光碳量子点混合液激发光谱和发射光谱Fig 1 The excitation and emission spectra of original carbon quantum dots

2.4碳量子点的红外光谱表征 3个典型组分(编号分别为10，24，37)的红外光谱图见图2C。可见3个组分的红外光谱相似，具有相同的红外特征峰，均出现了3 550,1 740,1 151和1 080 cm-1处的特征吸收峰。

2.5荧光量子产率的计算 荧光量子产率的测定方法参照文献[15]，用五点法测定组分10,24和37及掺磷碳量子点混合液的荧光量子产率。以硫酸奎宁为参比物质，测量碳量子点和硫酸奎宁的稀溶液在碳量子点最佳激发波长下的积分荧光强度和吸光度值(应小于0.1),计算荧光量子产率，公式为：

ΦX=ΦST×(GradX/GradST)×(ηX2/ηST2)

其中，ФX为待测物质的荧光量子产率，ФST为已知参比物质的荧光量子产率；GradX和GradST分别表示以待测物质和参比物质的积分荧光强度与吸光度作图工作曲线的斜率；ηX和ηST分别表示待测物质和参比物质的折光系数。0.1 mol/L 硫酸奎宁的荧光量子率为54%，0.1 mol/L 硫酸水溶液和碳量子点水溶液的折光系数相同，均为1.33。通过计算，发现硅胶柱层析法分离得到的组分10，24和37的荧光量子产率不同，分别为4.1%，5.2%和7.3%，未分离的碳量子点混合液的荧光量子产率为4.6%。

A：紫外-可见吸收光谱； B：荧光光谱(插图为其在365 nm紫外灯下的光学图); C:红外光谱图.图2 不同碳量子点的紫外光谱、荧光光谱表征及红外光谱图Fig 2 The UV-Vis absorption spectra， the fluorescence spectra and FTIR spectra of the different carbon quantum dots

3 讨 论

碳量子点的分离具有较大的可控性和灵活性，可对碳量子点进行有目的地分离，比如根据碳量子点的不同尺寸或者不同性质分别采用不同原理的方法将其分离，在分离过程中还能去除反应过程中的原料以及副产物，以实现对碳量子点进一步纯化的目的。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，用流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。本实验以吸附色谱法中应用最为广泛的硅胶为固体吸附剂，将混合物中各组分吸附到吸附剂上，用适当溶剂进行洗脱，利用不同极性的组分在硅胶表面吸附力不同，从而实现分离。吸附能力较弱的组分迁移速度快，先被洗脱；吸附能力较强的组分迁移速度慢，后被洗脱。在硅胶柱层析中，洗脱溶剂的恰当选择对改善分离效果也产生重要的影响，洗脱能力主要由其极性决定。对于复杂混合物的分离，可采用二元混合溶剂体系来提高分离的选择性。考虑到以果糖和膦甲酸钠水热法合成的磷掺杂碳量子点表面带有极性官能团，所选溶剂应对样品具有一定溶解性。因此，首先以乙酸乙酯这种中等极性溶剂为洗脱体系的主体，以乙醇极性溶剂为改性剂，考察该洗脱体系的分离效果，结果表明乙酸乙酯-乙醇洗脱体系对于碳量子点的洗脱强度太弱，同时由于乙醇的黏度大，降低了组分在两相间的传质速度，并削弱了柱子的渗透性，导致柱效下降，色谱条带不清晰，碳量子点样品也未被完全洗脱。然后选用乙醇-水洗脱体系，当改性剂水的含量稍微增加，即可使所有样品都被洗脱，说明乙醇-水洗脱体系的洗脱能力太强，组分间无法实现有效分离。最后考察乙酸乙酯-甲醇洗脱体系，洗脱过程中采用极性不断增加的梯度洗脱方式，通过调整乙酸乙酯和甲醇的体积比来改变洗脱剂的极性，使碳量子点合成产物中的各个组分逐渐分开，获得较为理想的分离效果。

实验采用硅胶柱层析技术，以乙酸乙酯-甲醇为洗脱体系分离纯化磷掺杂碳量子点，收集60个组分，通过考察组分的荧光性能，发现不同极性洗脱条件得到的组分间的激发波长与荧光发射波长存在较大差异，且随着洗脱剂极性的逐渐增大，洗脱得到的碳量子点的激发波长和发射波长不断红移，且斯托克位移均>90 nm，可有效避免激发峰与发射峰的重叠，有利于碳量子点在荧光分析检测方面的应用。

本研究选取3个典型组分进行紫外光谱表征，不同极性的组分间吸收峰位置略有差异，吸收曲线的形状与掺磷碳量子点混合液也存在明显不同。从荧光光谱中可观察到组分的极性增大，其发射波长往长波方向移动，荧光强度也随之出现增加趋势，说明水热法合成的碳量子点产物通过硅胶柱层析分离出的不同极性的碳量子点具有不同的光学性能。

采用红外光谱对3个组分进行表征，结果表明，3个组分具有相同的红外特征峰，其中3 550 cm-1处代表-OH特征吸收，1 740 cm-1处归属于羧基的C=O的伸缩振动，1 151 cm-1和1 080 cm-1分别归属于与膦甲酸钠结构相关的特征官能团P=O和P-O-R。组分10和组分24的3 550 cm-1和1 740 cm-1特征峰尖锐并离散，组分37在这两处特征峰则宽而集中，说明随着洗脱剂极性的增强，所得组分表面的-COOH增多，碳量子点的极性增加。

荧光量子产率又称为荧光效率，是荧光物质的重要发光参数。因此，本研究还测定了分离得到组分的荧光量子产率，结果表明碳量子点极性增大，发射波长发生红移，荧光量子产率也随之增强，出现分离后组分的荧光量子产率比未分离的碳量子点混合液的荧光量子产率大的现象，这可能是由于混合物中的碳量子点之间发生了能量共振转移，说明硅胶层析柱可根据极性不同实现碳量子点组分的初步分离。

本实验以果糖和膦甲酸钠为前驱体合成磷掺杂碳量子点，并利用硅胶柱层析色谱对碳量子点混合物进行分离纯化。经过优化洗脱条件，选用乙酸乙酯-甲醇洗脱体系对碳量子点进行分离。对不同洗脱条件下得到的碳量子点样品进行紫外-可见光谱、荧光光谱和红外光谱表征以及荧光量子产率的测定。分离后的碳量子点组分具有未分离的碳量子点混合液不同的光学性能，随着碳量子点极性的增大，组分的发射波长逐渐红移。说明硅胶柱层析可有效分离碳量子点，后续处理步骤简单，组分损耗小，成本低，可实现碳量子点的批量分离纯化，为获得高质量的荧光碳量子点提供可能性，有利于其在荧光分析和生物成像等领域中的应用。