注射用氨苄西林钠氯唑西林钠质量评价

李一兰 周晓溪 姚羽 田方 张玲变 秦爱方

(山西省食品药品检验所，太原 030001)

注射用氨苄西林钠氯唑西林钠为氨苄西林钠和氯唑西林钠等量混合的无菌粉针剂，即对革兰阳性菌和阴性菌有广谱杀灭作用，又对耐青霉素的金黄色葡萄球菌有效[1-2]，适用于敏感菌所致的呼吸道感染、胃肠道感染、尿路感染、软组织感染、心内膜炎、脑膜炎、败血症等，也可用于化脓性链球菌或肺炎球菌与耐青霉素葡萄球菌所致的混合感染。注射用氨苄西林钠氯唑西林钠均由无菌原料药直接分装而成，规格为0.5g、1.0g、1.5g和2.0g。

注射用氨苄西林钠氯唑西林钠为2016年国家评价性抽验品种，此次抽验的目的在于客观地评价国内药品的质量现状；客观分析产品存在的主要质量问题，进而为进一步提高产品质量指明方向[3-5]。氨苄西林钠有溶媒结晶、冷冻干燥、喷雾干燥3种生产工艺[6]。氯唑西林钠为溶媒结晶生产工艺。依据氨苄西林钠原料的生产工艺，本次评价样品可分为两种：溶媒结晶氨苄西林钠样品与冷冻干燥氨苄西林钠样品，分别简称为结晶氨苄样品与冻干氨苄样品。本文对国内市场上的注射用氨苄西林钠氯唑西林钠依据现行药品质量标准进行检验并进行探索性研究，结合标准检验及探索检验结果对质量进行系统地分析，从而对现行药品质量标准提出合理的改进建议，为注射用氨苄西林钠氯唑西林钠质量标准的进一步完善和今后的监督管理提供重要依据[7-8]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters E2695高效液相色谱仪；Mettler AE240电子天平； Mettler Toledo SevenMulti酸度计；Mettler Toledo DL38水分滴定仪；温控水分活度仪(Novasina，Awsprint)；Ultimate 3000 高效液相色谱仪系列；Thermo Scientific公司Q ExactiveFocusTM组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪。

1.2 试药

氨苄西林对照品：批号130410-201207，含量86.5%；氯唑西林对照品：批号130423-200903，含量91.0%；氨苄西林系统适用性对照品：批号130618-201202；均购自中国食品药品检定研究院。45批次注射用氨苄西林钠氯唑西林钠为2016年国家药品评价性抽验样品(其中冻干氨苄样品43批次，结晶氨苄样品2批次)，另有2批次结晶氨苄样品为调研样品，分别抽自国内6家生产企业。水为自制超纯水，乙腈为Dikma公司生产的色谱纯，其余所用试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 法定检验

本次抽验的样品按照国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第七册[9]进行检验。主要检验项目为水分、有关物质、含量测定等。

2.2 探索性研究

根据法定检验结果，结合文献报道[8,10-11]以及品种特点、专题调研等情况，重点开展晶型、水分与水活度、有关物质等项目的探索性研究。

2.2.1 晶型测定

选取不同生产工艺样品及原料，采用粉末X-射线衍射测定晶型。

2.2.2 水分与水活度

分别将不同生产工艺的样品各2批次置于相对湿度75%的环境中，开盖放置，取样时间为间隔2h，分别选用水分测定仪和温控水分活度仪测定其水分和25℃水活度。

管道输水灌溉和滴灌的单井控制面积应根据公式（1）计算，并结合片区的空间分布确定，原则上采用的单井控制灌溉面积不小于计算值的10亩。喷灌工程的单井控制面积的确定还应结合喷灌机的选型确定。审查中要严格控制单井控制面积，一方面尽量少打井减少投资，另一方面可促进节水，避免水资源的浪费。

2.2.3 有关物质

(1)有关物质测定：现行标准采用等度洗脱法，不能有效分离杂质，参照2015年版中国药典二部[12]氨苄西林钠方法建立本品有关物质梯度洗脱法：采用十八烷基硅烷键合硅胶(4.6mm×250mm, 5μm)为填充剂；流动相A为12%乙酸溶液-0.2mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈-水(0.5:50:50:900, V/V/V/V)；流动相B为12%乙酸溶液-0.2mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈-水(0.5:50:400:550, V/V/V/V)；检测波长为254nm。先以流动相A-流动相B(85:15, V/V)等度洗脱，待氨苄西林峰洗脱完毕后立即按表1进行线性梯度洗脱。

(2)杂质的确证：通过UPLC-MS切换技术在线脱盐，一维色谱条件参照有关物质测定，二维色谱条件为色谱柱AcclaimTMPolar Advantage ⅡC18(4.6mm×50mm, 3μm)；流速: 0.5mL/min；柱温:30℃；流动相为水:乙腈=80:20(V/V)。利用质谱进行杂质一级和二级扫描：根据二维上的出峰时间，设置质谱阀切换参数，进行一级和二级扫描。质谱条件：鞘气流速：40L/min；辅气流速：5L/min；反吹气流速：1L/min；喷雾电压：3.5kv；毛细管温度：320℃；辅气加热温度：400℃；全扫描：分辨率：35000；扫描范围：200-2000。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Linear gradient elution program

2.2.4 稳定性试验

分别将不同生产工艺样品进行加速试验，在40℃条件下分别放置10、20和30d，对溶液的澄清度与颜色、含量、有关物质等进行测定。

3 结果与讨论

3.1 法定检验结果

47批次样品按现行药品质量标准检验均符合规定，合格率为100%。水分、有关物质等主要检查项目与产品质量密切相关，因此对其结果进行统计分析。

3.1.1 水分

对47批次样品的水分数据进行统计分析，结晶氨苄样品为1.98%～2.02%，冻干氨苄样品为2.35%～2.64%，结晶氨苄样品水分低于冻干氨苄样品。

3.1.2 有关物质

对47批次样品的总杂质数据(等度洗脱)进行统计分析，结晶氨苄样品总杂质量为0.54%～0.63%，冻干氨苄样品总杂质量为1.34%～2.07%，结晶氨苄样品总杂质量低于冻干氨苄样品。

3.2 探索性研究

3.2.1 晶型测定

结晶氨苄西林钠原料具有多个特征衍射峰为结晶型粉末，冻干氨苄西林钠原料无特征衍射峰出现为无定型粉末；氯唑西林钠原料为结晶型粉末。结晶氨苄样品均具有相应特征衍射峰，冻干氨苄样品仅呈现氯唑西林钠特征衍射峰(图1)。

3.2.2 水分与水活度

图1 粉末X-射线衍射图Fig.1 Powder X-ray diffraction

冻干氨苄样品与结晶氨苄样品8h水活度和水分平均上升率均存在一定差异，结晶氨苄样品8h水分平均增长率1.15%/h，水活度平均增长率0.034/h；冻干氨苄样品8h水分平均增长率1.22%/h，水活度平均增长率0.056/h；冻干氨苄样品初始水活度明显低于结晶氨苄样品，8h时其水活度与结晶氨苄样品一致，其增长速率高于结晶氨苄样品(图2)；一般认为样品在水活度越小时质量越稳定，本次试验发现，初始水活度低的冻干氨苄样品稳定性次于初始水活度高的结晶氨苄样品，提示晶型对本品质量的影响大于水活度的影响[13]。

图2 不同生产工艺样品水活度及水分测定结果比较图Fig.2 The comparison of water activity and water determination results in samples of different production processes

3.2.3 有关物质

为了能够更好地反映样品的杂质谱，对现行标准的有关物质测定方法进行改进，建立了洗脱能力更强，分离效果更好的梯度洗脱法，与现行标准的等度洗脱法(图3)比较，其洗脱能力更强，检出的杂质总量更多(图4)。47批次样品杂质个数和杂质总量均明显增加(杂质总量增加了0.02%～1.67%)。

探索性研究结果表明，利用氨苄西林系统适用性对照品、氯唑西林杂质对照品及通过UPLC-MS切换技术在线脱盐实现磷酸盐液相条件杂质的定性，研究样品16个杂质(其中杂质3、9、15、16由UPLCMS确证)并结合原料药杂质检出情况和破坏性试验对杂质结构及来源进行了归属(表2)。通过主成分自身对照法计算各杂质含量，分析47批次样品的杂质检出和分布情况(图5)。图5显示不同生产工艺样品均能检出这9个杂质，其中编号为1(氨苄西林噻唑酸)、5(氨苄西林闭环二聚体)、6(未知杂质6)、9(氨苄西林闭环三聚体)、15(6-氨基青霉烷酸氯唑西林酰胺)、16(未知杂质16)为主要杂质，且各杂质平均含量均大于0.1%；其中5号杂质为冻干氨苄样品最大单个杂质，16号杂质为结晶氨苄样品最大单个杂质[14-16]。

样品生产工艺为无菌原料直接混合分装，结合原料药和制剂杂质检出情况，制剂的杂质均与原料药及其降解物一致，提示原料药的质量影响制剂质量。

3.2.4 稳定性考察

图3 注射用氨苄西林钠氯唑西林钠有关物质等度洗脱典型图谱Fig.3 Isocratic elution program system HPLC chromatogram of ampicillin sodium and cloxacillin sodium for injection in related substances

图4 注射用氨苄西林钠氯唑西林钠有关物质梯度洗脱典型图谱Fig.4 Gradient elution program system HPLC chromatogram of ampicillin sodium and cloxacillin sodium for injection in related substances

图5 不同生产工艺样品较大9个杂质平均含量比较图Fig.5 Thecomparisonof 9 impurities contents in ampicillin sodium and cloxacillin sodium

两种生产工艺的样品在40℃的条件下进行加速试验[4]。比较样品中的特定杂质氨苄西林闭环二聚体，总杂质、氨苄西林和氯唑西林纯度变化，发现冻干氨苄样品的闭环二聚体、总杂质量均增加，氨苄西林纯度降低，氯唑西林纯度无明显变化；结晶氨苄样品闭环二聚体，总杂质、氨苄西林和氯唑西林纯度无明显变化。提示冻干氨苄样品受存储温度影响较大，在存储过程中不稳定。

3.2.5 相关分析

将47批次样品的水分、氨苄西林闭环二聚体、杂质总量、纯度检验结果和生产工艺类型等进行多因素相关分析(见表3)表明：①不同氨苄西林钠原料生产工艺与样品的水分、氨苄西林闭环二聚体、杂质总量、氨苄西林纯度等均显著相关(P＜0.01)，提示氨苄西林钠原料的生产工艺是影响本品质量的重要因素；②样品的氨苄西林纯度与水分、杂质总量等均显著相关，提示水分亦是影响样品纯度变化的主要原因。

表2 注射用氨苄西林钠氯唑西林钠杂质的归属Tab.2 The impurity ascription of ampicillin sodium and cloxacillin sodium for injection

4 小结

本次评价性抽验结果显示，注射用氨苄西林钠氯唑西林钠总体质量较好，产品合格率100%，但现行质量标准需进一步完善，建议采用梯度洗脱的方法进行有关物质检查，并对氨苄西林闭环二聚体等特定杂质进行控制。探索性研究表明采用不同生产工艺氨苄西林钠原料药生产的样品质量存在明显差异，冻干氨苄样品质量不及结晶氨苄样品，且更易受温度的影响，提示原料药的质量影响制剂质量。因此，应引导企业首选溶媒结晶工艺氨苄西林钠原料。

表3 主要项目检测结果多因素相关分析Tab.3 Multi-factors correlation analysis of the maior items determination results