蓝莓枝干溃疡病病原鉴定及品种抗病性研究

康海婷，凌丹燕，2，吴志娟，路 梅，宗 宇，郭卫东，*

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004； 2.金华市荆龙生物科技有限公司，浙江 金华 321000)

蓝莓(blueberry)是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生灌木果树，其果实富含维生素、矿物质、抗氧化物质和花青素，具有较高的营养价值和医疗保健作用[1]。我国从1983年开始进行蓝莓的引种栽培，经过30多年的发展，现已初步形成了东北地区、山东半岛、长江中下游和云贵高原4个主产区[2]。浙江省、江苏省和江西省等长江中下游地区均有较大规模的蓝莓种植，其中以浙江省栽培面积最大。随着栽培规模的不断扩大，影响蓝莓树体生长、果实质量和产量的真菌性病害逐渐凸显出来，给蓝莓产业带来了重大损失[3-5]。

枝干溃疡病是浙江省近年新发生最为严重的蓝莓病害之一，该病会导致蓝莓枝干大量枯死，果实产量大幅度降低。国内外研究发现，导致蓝莓枝干溃疡病的病原较多，主要为葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。葡萄座腔菌主要通过伤口侵染植株，尤其是每年5—6月雨水充沛的季节，受到机械损伤的蓝莓植株在自然界被侵染的机率大大增加[4-5]。蓝莓枝干溃疡病与其他病原菌引起的枝条枯萎病等病害的症状非常相似，仅发病起始位置有差异，病原菌初始侵染时间短，田间不易察觉，这为枝干溃疡病的防治带来了较大困难[6]。因此，进行病原菌的快速分离鉴定、筛选抗病性强的品种成为蓝莓枝干溃疡病的关键防治策略。

本研究采集蓝莓不同品种的染病叶片和枝条，采用传统形态学和分子生物学结合的方法对分离菌株进行鉴定，以期明确浙江省金华市疑似枝干溃疡病的蓝莓病株的病原菌，为该病的田间诊断及综合防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 蓝莓样品采集、病原菌分离和形态学观察

2015年3月至2016年3月在浙江师范大学蓝莓基地采集蓝莓染病枝条，记录其发病症状并拍照。

参考方中达常规组织分离法并进行改良[7]，对具备典型症状的病样用水冲洗，从病健交界处剪取病样材料，放入75%乙醇中表面消毒30 s，无菌水漂洗3次后置于1% NaClO溶液中消毒10 min，之后用无菌水漂洗3次，用灭菌滤纸吸干表面水分。在无菌条件下将材料剪成0.5 cm×0.5 cm的组织块，将其置于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基中25 ℃进行培养。培养3 d后挑取菌落边缘菌丝转接到PDA培养基上进行纯化培养。将分离纯化后的病原菌株置于PDA培养基进一步培养，培养条件为25 ℃，16 h光照/8 h黑暗。每天观察菌落生长状态和产孢情况。培养7 d后，在显微镜下观察病原菌菌丝及孢子形态，进行病原菌的初步鉴定。

1.2 病原菌DNA提取与rDNA-ITS序列扩增

将分离得到的菌株于PDA固体培养基培养5 d后，采用改良CTAB法提取基因组DNA[8]，使用通用引物ITS1/ITS4进行rDNA-ITS区段扩增。PCR反应体系为25 μL，包括：10×PCR缓冲液2.5 μL，10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL，10 μmol·L-1ITS1和ITS4引物各1.0 μL，DNA模板溶液2.0 μL，5 U·μL-1Taq酶0.5 μL，ddH2O 16.0 μL。扩增条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送上海英潍捷基生物公司测序。

将分离菌株JA4和JB2的rDNA-ITS序列与GenBank中相关序列进行相似度比较，并用MEGA 7.0[9]软件基于邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。

1.3 病原菌致病性检测

通过柯赫氏法则(Koch’s postulates)对病原菌进行致病性检测。采集健康且大小均匀的蓝莓枝干，用75%乙醇表面消毒，无菌水清洗晾干备用。使用直径5 mm打孔器在纯化培养5 d的病原菌培养基上沿菌落边缘打孔，然后用无菌3号昆虫针在蓝莓枝干表面针刺“+”(长宽和深度均为5 mm)，菌丝面朝下贴于枝条表面，每个蓝莓枝干样品接种3个病原菌菌饼，同时接种空白PDA培养基作为对照。处理后的蓝莓枝干在25 ℃、16 h光照/8 h黑暗条件下保湿培养，每天观察并记录发病情况，选取发病明显的枝条进行病原菌的再分离鉴定。

1.4 不同蓝莓品种抗病性测定

以2年生蓝莓布里吉塔、奥尼尔、蓝丰、蓝美人和夏普蓝为供试品种，每个品种剪取并筛选健康、生长一致的枝条30根。每个品种选择5根枝条作为对照，剩余25根枝条接种病原菌。用75%乙醇表面消毒后将枝条置于铺有保湿滤纸的保鲜盒内培养。接种后喷雾保湿并封闭保鲜盒，置于25 ℃，16 h光照/8 h黑暗保湿培养诱导发病，7 d后记录不同品种的发病情况。

2 结果与分析

2.1 田间病害症状观察

蓝莓枝干溃疡病主要为害植株枝条，包括主干和侧枝。初期在枝干表面出现紫红色斑点，后逐渐扩展为椭圆形或者圆形大斑。一般情况下病斑从发病部位向四周扩散，病斑表面呈现凹陷开裂。发病严重时开裂贯穿整棵植株，影响植株的生长(图1-a、b)；高湿条件下，病害枝条表面出现菌丝体，呈现白色(图1-c)；发病枝条横切面呈现棕黄色(图1-d)。

a，发病植株；b，发病植株基部；c，发病枝条上分生孢子丝及分生孢子角；d，枝条横切面。a， Infected plant; b， Base of the infected plant; c， Spore filaments and conidium angles on the infected branches; d， Cross section of branches.图1 蓝莓茎溃疡病典型症状Fig.1 Typical symptoms of blueberry stem canker

2.2 枝干溃疡病病原菌分离纯化

从蓝莓病枝分离得到疑似病原菌菌株15株(JA1-JA8、JB1-JB7)。将疑似病原菌分别进行柯赫氏法则验证，回接材料为蓝莓品种布里吉塔。结果表明，接种JA4和JB2菌株5 d后可以看到病斑产生，且后期病斑与蓝莓枝干溃疡病田间自然发病症状相同；15 d后蓝莓枝条呈现枯萎状，而对照组中未产生病斑或与自然症状不一致。对接种发病后的枝条再次进行病菌的分离培养，生长状态与接种病原菌一致；因此菌株JA4和JB2为蓝莓枝干溃疡病致病菌。

a，JA4菌株侵染处理组；b，JA4对照组；c，JB2菌株侵染处理组；d，JB2对照组。a， Infection treatment group of strain JA4; b， Control group of JA4; c: Infection treatment group of strain JB2; d， Control group of JB2.图2 蓝莓枝干溃疡病病原菌JA4和JB2致病性检测Fig.2 Pathogenicity test of strain JA4 and JB2 on blueberry branch

2.3 病原菌传统形态学鉴定

2.3.1 病原菌JA4形态学特征

将分离得到的JA4菌株在PDA培养基进行培养，菌丝初期呈现白色，5 d后菌落直径达到9 cm；随着培养时间增长，菌丝颜色逐渐加深，变成灰白色(图3-a)；菌丝相互缠绕，形成黑色球形颗粒状的分生孢子器(图3-b)；分生孢子器于15 d开始产生分生孢子。光学显微镜镜检发现，JA4病原菌菌丝具隔膜，直径2.0～10.0 μm(图3-c、d)；分生孢子梗在基部和顶部有分枝，无色，通常具多个隔膜(图3-e)。分生孢子为钩状β型分生孢子，单孢，无色，无油球，大小为15～20 μm×1～3 μm(图3-f)。

a，菌落；b，分生孢子器；c，菌丝(400×)；d，菌丝膨大(400×)；e，分生孢子器(400×)；f，分生孢子(400×)。a， The colony morphology on PDA plate; b， Pycnidium; c， Mycelia; d， Expanded mycelium of JA4 (400×); e， Pycnidium (400×); f， Conidium(400×).图3 拟茎点霉菌JA4在PDA培养基上形态Fig.3 Morphology of Phomopsis sp. JA4 on PDA medium

2.3.2 病原菌JB2形态学特征

将分离得到的JB2菌株在PDA培养基进行培养，菌丝初期呈白色绒状，与JA4菌株生长速度相似，5 d后菌落直径达到9 cm。菌丝生长旺盛，气生菌丝发达，随着培养时间增长，菌丝颜色也呈现逐渐加深的趋势，变成灰黑色至黑色，产生分生孢子器(图4-a、b)；20 d开始产生分生孢子。显微镜观察发现，菌丝具隔膜，灰黑色至黑色(图4-c、d)；分生孢子器聚生或单生，单腔，分生孢子椭圆形，大小20～30 μm×5～8 μm(图4-e、f)。

a，菌落；b，分生孢子器；c，菌丝(400×)；d，菌丝膨大(400×)；e，分生孢子器(400×)；f，分生孢子(400×)。a， The colony morphology on PDA plate; b， Pycnidium; c， Mycelia; d， Mycelium enlargement (400×); e， Pycnidium (400×); f: Conidium (400×).图4 葡萄座腔菌JB2在PDA培养基上形态Fig.4 Morphology of Botryosphaeria dothidea JB2 on PDA medium

2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

分别以菌株JA4、JB2的基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4对核糖体rDNA-ITS进行PCR扩增，得到大小约500 bp的片段。与GenBank已经报道的真菌ITS序列进行聚类分析，结果表明，菌株JA4和JB2分别与拟茎点霉属真菌(Phomopsissp.)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)以较高的自检支持率聚在一起(图5)。结合菌丝和分生孢子的形态学特征，初步判断菌株JA4为腔孢纲(Coelomycetes)球壳孢目(Sphacropsidales)拟茎点霉属(Phomopsis)真菌；菌株JB2是子囊菌纲(Ascomycetes)假球科目(Pleosporales)葡萄座科(Botryosphaericeae)的葡萄座腔菌。

图5 基于JA4和JB2菌株及相似属种rDNA-ITS序列构建的聚类树Fig.5 Phylogenetic tree of strains JA4， JB2 and relative genera based on rDNA-ITS sequences

不同品种间没有相同字母表示抗病性差异显著(P<0.05)。Different letters indicated significant differences on disease resistance among different varieties(P<0.05).图6 不同蓝莓品种对枝干溃疡病抗病性检测Fig.6 Resistance detection of different blueberry cultivars to branch stem canker

2.5 不同蓝莓品种抗病性分析

将JA4和JB2两种病原菌活体接种布里吉塔、奥尼尔、蓝丰、蓝美人和夏普蓝等5个蓝莓品种上，观察不同品种的抗病性差异。结果表明，供试蓝莓品种的枝条均出现不同程度的发病症状，发病率为100%。葡萄座腔菌菌株JB2的致病性强于拟茎点霉属真菌菌株JA4。供试的5个蓝莓品种中，夏普蓝和奥尼尔对两种病原菌的抗性最差，两个品种对病原菌JA4的抗性差异不显著，夏普蓝对病原菌JB2的抗性显著弱于其他品种。布里吉塔、蓝丰和蓝美人3个品种对两种病原菌的抗性较强，三者抗性之间无显著差异。

3 讨论

蓝莓枝干溃疡病在世界上许多国家发生并有相关报道，美国和加拿大的蓝莓种植区是该病发生最严重的地区[1，5，10]。葡萄座腔菌属真菌是引起枝干溃疡病的主要病原菌，该属真菌腐生或寄生于植物体内，或以内生真菌形态存在，可引起苹果(Malus)[11]、桃树(Prunucepersica)[12]、葡萄、芒果、核桃(Juglansregia)[13]等果树的枝干溃疡枯萎、干腐、流胶等不同症状，造成果树严重减产。蓝莓枝干溃疡病在我国云南省[4]、辽宁省[1]等蓝莓种植区均有发生，引起这两地枝干溃疡病的病原菌为葡萄座腔菌(B.dothidea)[4-5]，这与本研究中鉴别出的病原菌相同。

葡萄座腔菌科真菌多为弱寄生菌，条件适宜时容易引起植物病害，对农林生产有着重要的影响，特别是葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)和新壳梭孢属(Neofusicoccum)等的优势类群会引起植物茎、枝条或新梢干枯、溃疡等病症[12，14-15]。在蓝莓上已有病原菌B.dothidea和B.corticis[16-17]、Neofusicoccumarbuti和N.parvum[6，18-19]引起枝干溃疡病发生的病例报道。葡萄座腔菌科真菌有寄主专化型和广谱寄生型[20]，这与该科真菌种类繁多，分类地位不明确有关[14，21]。徐成楠等[22]的研究表明，B.dothidea属于广谱寄生性真菌，蓝莓栽培园周边的果树可能是B.dothidea的初侵染源。因此，在蓝莓种植园选址时应考虑周边果树的栽植及病害发生的动态情况，这为蓝莓枝干溃疡病的早期监测及综合防控提供参考。

除葡萄座腔科真菌外，座囊菌属(Dothidea)真菌也可以导致蓝莓枝干溃疡病[23-26]。本研究分离的JA4病原菌被鉴定为拟茎点霉菌(Phomopsissp.)，是座囊菌属的无性型，多数拟茎点霉菌产生α和β两类分生孢子。罗丽娟等[27]通过对23个拟茎点霉菌株研究指出，不同的培养基可以诱导拟茎点霉产生不同类型的孢子。在本研究中，JA4菌株的分离纯培养使用的均是PDA培养基。因此推测，培养基的单一使用可能是未产生α型分生孢子的原因。后续研究中，开展不同纯培养条件下JA4孢子形成的相关实验。座囊菌属真菌可以侵害高丛蓝莓、兔眼蓝莓、黑果越橘、越橘和蔓越橘等越橘属的多个种，导致枝干溃疡、枝枯和果腐等病症[24]。岳清华等[25]指出拟茎点霉菌和葡萄座腔菌导致的蓝莓枝干溃疡的症状十分相似，在田间鉴别中很难区分；但拟茎点霉菌在春天条件适宜情况下可由花芽侵入，而葡萄座腔菌必须从伤口侵染[15]。本研究在进行两种病原菌致病性检测回接中对枝条都进行了划伤处理，不能排除两种病原菌产生复合侵染的可能性，前人在蓝莓染病表皮组织切片中观察到葡萄座腔菌子囊孢子也为复合侵染的存在提供了进一步的证据[15]。

枝干溃疡病病原菌的多样性加大了病害防治的难度，筛选抗病蓝莓品种是病害综合防治的有效途径之一。在本研究供试的5种蓝莓品种中，虽不同程度地感染了葡萄座腔菌和拟茎点霉菌，但品种间抗病性存在显著差异。新建蓝莓园应选用抗病性较强的布里吉塔、蓝美人或蓝丰等品种，减少易感病品种夏普蓝和奥尼尔的栽种数量。对于夏普蓝和奥尼尔栽植面积较大的建成果园，应定期检查园内植株发病情况，及时清除病枝，做好田间药剂防控。

4 结论

拟茎点霉菌(Phomopsissp.)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)均可以引起蓝莓枝干溃疡病，拟茎点霉菌在春天条件适宜情况下可由花芽侵入，而葡萄座腔菌必须从伤口侵染；两种病原菌也可以产生复合侵染。蓝莓品种布里吉塔、蓝美人和蓝丰等品种抗性强；夏普蓝易受病原菌侵染，抗病性差。