TLR4-NFκB信号通路在顺铂致胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用

段永庆

(昆明医科大学第二附属医院胃肠外科，云南昆明650000)

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，以顺铂为基础的一线化疗方案是胃癌常用的治疗方法，但是研究发现约50%的胃癌患者对顺铂已产生耐药性，可能由于癌细胞表面P-糖蛋白过度表达，从而将顺铂从细胞内泵出细胞外[1-2]。研究发现，化疗药物可以在各种肿瘤细胞系中普遍诱导NFκB和各种炎性细胞因子的表达，显著降低了化疗药物的致凋亡效应，提示NFκB介导的炎症信号通路参与肿瘤细胞的药物抵抗[3-6]。TLR4是一种模式识别受体，可以与外界微生物、自身降解物、药物等相互作用，激活下游NFκB介导的炎症信号通路[7-8]。尽管如此，关于TLR4-NFκB信号通路在顺铂致胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用，仍然缺乏直接有效的证据，因此我们在本文中通过构建TLR4 siRNA阻断TLR4-NFκB信号通路，以观察胃癌SGC-7901细胞在顺铂致凋亡作用中的变化。

1 材料与方法

1.1 SGC-7901细胞培养与顺铂处理

人胃癌SGC-7901细胞购买于中国科学院细胞库。使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养于37℃、5% CO2的细胞培养箱中，当细胞培养至汇合度达到70%左右时，加入0.25%的胰蛋白酶消化，使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液终止后进行传代培养。将SGC-7901细胞分为两组，即正常对照组(Control group)和顺铂处理组(DDP group)。顺铂处理组细胞中加入终浓度为10 μmol/L的顺铂处理12 h，加入相同体积的PBS作为正常对照组。处理12 h后收集细胞，使用Western blot检测SGC-7901细胞中TLR4和NFκB的表达情况。

1.2 TLR4 siRNA的转染

根据GenBank数据库TLR4核苷酸序列(ND-7099)，设计合成TLR4 siRNA序列(Anti-TLR4)和无义序列(Scramb-Anti-TLR4)，具体序列见表1。转染前以5105个/孔的细胞数将SGC-7901细胞接种至6孔细胞培养板，加入10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养至汇合度70%左右，吸弃培养基后加入PBS洗涤，加入1500 μL无血清的RPMI 1640培养基。将5 μL的siRNA与250 μL的RPMI 1640培养基混合，静置5 min，配置成溶液1；将5 μL的LipofectamineTM2000与250 μL的RPMI 1640培养基混合，静置5 min，配置成溶液2；将溶液1与溶液2混合后，室温静置20 min，以形成siRNA-LipofectamineTM2000复合物，即转染液。将转染液加入至6孔板中，轻轻混匀后放置于细胞培养箱中继续培养6 h，转染结束后吸弃培养基加入PBS洗涤，使用10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养24 h。随后，两组细胞，即无义序列转染组(Scramb-Anti-TLR4 group)和TLR4 siRNA序列转染组(Anti-TLR4 group)(见表1)，均加入终浓度为10 μmol/L的顺铂处理，处理12 h后收集细胞，用于后续的Western blot和流式细胞术检测。

表1 siRNA序列

1.3 Western blot检测

取105个细胞，加入100 μL的细胞裂解液和终浓度为1 mM的PMSF，混匀后充分裂解。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测总蛋白浓度，取40 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。每4 μL的蛋白质溶液加入1 μL的5SDS-PAGE上样缓冲液，混匀后，100℃水浴中将蛋白变性5 min，冷却至室温后上样进行电泳，蓝色染料到达胶底部时停止电泳。在冰水浴中以100 mA恒流转膜2 h，将转膜后的聚偏二氟乙烯膜用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，用抗TLR4抗体(1∶500)、抗NFκB抗体(1∶2000)、抗Bax抗体(1∶1000)、抗Bcl-2抗体(1∶1000)、抗Activecaspase-3抗体(1∶500)、抗GAPDH抗体(1∶5000)4℃过夜孵育。洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶2000)，室温孵育1 h，洗涤3次后，加入ECL显色液后于凝胶成像仪下曝光和拍照。使用ImageJ测定灰度值，将对照组的灰度值设置为1。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡和坏死

使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测，具体步骤为：取105个细胞，1000 g离心5 min后，加入195 μL的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL的AnnexinV-FITC和10 μL的碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液，混匀，室温避光孵育20 min后置于冰上，使用流式细胞仪检测。

1.5 统计学方法

分别使用SPSS 20.0软件和Graph Pad Prism 6.0软件进行统计学处理和作图，所有计量数据均符合正态分布，以均数±标准差表示，两组间计量数据的比较使用t检验。当P<0.01时，以**表示。

2 结果

2.1 顺铂对SGC-7901细胞TLR4和NFκB表达的影响

Western blot的结果显示，与不经顺铂处理的正常对照组相比较，顺铂处理后TLR4(t=14.070,P<0.001)和NFκB(t=17.660,P<0.001)的表达显著增加(见图1A-D)。

图1 顺铂对SGC-7901细胞TLR4和NFκB表达的影响

A：Western blot检测TLR4的表达，B：Western blot检测NFκB的表达，C：TLR4表达的灰度值统计图，D：NFκB表达的灰度值统计图。**P<0.01。

2.2 TLR4 siRNA转染对顺铂诱导SGC-7901细胞TLR4和NFκB表达的影响

Western blot的结果显示，与Scramb-Anti-TLR4无义序列转染的SGC-7901细胞相比较，Anti-TLR4序列转染组在顺铂处理后TLR4(t=16.810,P<0.001)和NFκB(t=15.040,P<0.001)表达显著下降(见图2A-D)。

图2 TLR4 siRNA转染对顺铂诱导SGC-7901细胞TLR4和NFκB表达的影响

A-B：Western blot检测Scramb-Anti-TLR4和Anti-TLR4序列转染的SGC-7901细胞经顺铂处理后的TLR4和NFκB的表达情况，C-D：两组细胞TLR4和NFκB表达的比较。**P<0.01。

2.3 TLR4 siRNA转染对顺铂诱导SGC-7901细胞凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot的结果显示，与Scramb-Anti-TLR4无义序列转染的SGC-7901细胞相比较，Anti-TLR4序列转染组在顺铂处理后Bax(t=17.870,P<0.001)和Activecaspase-3(t=8.881,P<0.001)表达显著升高，Bcl-2(t=17.300,P<0.001)表达显著下降(见图3A-B)。

图3 TLR4 siRNA转染对顺铂诱导SGC-7901细胞凋亡相关蛋白表达的影响

A：Western blot检测Scramb-Anti-TLR4和Anti-TLR4序列转染的SGC-7901细胞经顺铂处理后的Bax、Bcl-2、Activecaspase-3的表达情况，B：两组细胞Bax、Bcl-2、Activecaspase-3表达的比较。**P<0.01。

2.4 TLR4 siRNA转染对顺铂诱导SGC-7901细胞凋亡和坏死的影响

流式细胞术的结果显示，与Scramb-Anti-TLR4无义序列转染的SGC-7901细胞相比较，Anti-TLR4序列转染组在顺铂处理后细胞凋亡率(t=4.122,P<0.001)和坏死率(t=9.367,P<0.001)均显著升高(见图4A-D)。

图4 TLR4 siRNA转染对顺铂诱导SGC-7901细胞凋亡和坏死的影响

A-B：流式细胞术检测Scramb-Anti-TLR4和Anti-TLR4序列转染的SGC-7901细胞经顺铂处理后的细胞凋亡和坏死情况。C-D：两组细胞凋亡率和坏死率的比较。Q1：检测误差，Q2：坏死细胞，Q3：正常细胞，Q4：凋亡细胞，**P<0.01。

3 讨论

TLR4是模式受体家族中的成员，主要表达于抗原提呈细胞，但也广泛的表达于一系列肿瘤细胞系中，如sLNCaP、DU145、PC3、PANC-1、BxPC-3等[9-10]。TLR4不仅参与感染的免疫抵抗，也在肿瘤的起始和进展中发挥关键的病理作用，如TLR4可以促进人非小细胞肺癌细胞的免疫逃逸，支持卵巢癌细胞的生长和增殖，增强结直肠癌细胞的侵袭和转移[11-12]。Li等[13]人发现TLR4在非小细胞肺癌患者中高表达，而且表达水平与肿瘤的分期和转移密切相关，通过RNA干扰TLR4的表达可以显著抑制A549细胞的增殖，诱导细胞的凋亡，提示TLR4也可能在肿瘤细胞的耐药机制中发挥作用。我们在本文中也发现顺铂可以诱导胃癌SGC-7901细胞的TLR4表达，通过siRNA特异性阻断TLR4表达后，可以增强凋亡促进蛋白Bax、Activecaspase-3的表达，抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，使SGC-7901细胞在顺铂处理后的凋亡率与坏死率均显著升高，因此TLR4的阻断可以作为顺铂治疗胃癌的辅助方法[14]。

NFκB是TLR4下游重要的效应分子，其介导的炎症信号通路可被各种化疗药物诱导激活，尤其是在铂类、蒽环类、紫杉烷化疗药物中表现更为突出[15]。通过阻断NFκB的表达可以显著增强化疗药物的致凋亡效应[16-18]，例如硼替佐米是目前唯一一种批准进入临床的蛋白酶体抑制剂，可以抑制NFκB的表达和活性，防止NFκB依赖的细胞幸存途径的激活，已被广泛的用于肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病等肿瘤中的治疗[19-20]。我们在本文也发现，顺铂可以诱导胃癌SGC-7901细胞的NFκB表达，在特异性阻断TLR4表达后，NFκB的表达也随之降低，最终引起SGC-7901细胞在顺铂处理后凋亡率与坏死率均显著升高，因此TLR4-NFκB信号通路在顺铂致胃癌SGC-7901细胞凋亡中发挥抑制作用，可能是胃癌细胞对顺铂耐药的主要机制。

尽管本研究初步探讨了TLR4-NFκB信号通路在顺铂致胃癌SGC-7901细胞凋亡中的抑制作用，但是仍然有许多不足之处：①本文仅使用了普通的SGC-7901细胞作为研究对象，TLR4-NFκB信号通路是否在胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP中发挥同样的凋亡抑制作用仍然需要进一步研究；②本文仅将TLR4进行特异性阻断以研究后续的生物学效应，而阻断NFκB又能否达到相同的凋亡增强效应，分别阻断两种分子对胃癌细胞的凋亡率是否有差异；③本文仅在体外细胞水平探讨TLR4-NFκB信号通路的作用，实验结果的稳定性和可靠性均不如动物实验，因此仍然需要进一步构建体内动物模型以验证结论；④TLR4作为一种模式识别受体，尽管NFκB是其下游的主要效应分子，但仍然有众多其他效应通路，因此阻断TLR4高表达的凋亡增强效应是否有其他下游信号通路参与。

综上所述，顺铂可以激活胃癌SGC-7901细胞的TLR4-NFκB信号通路，抑制TLR4-NFκB信号通路可以增强顺铂的致凋亡效应。我们未来将进一步探讨TLR4-NFκB信号通路在胃癌耐药细胞株SGC-7901/DDP和体内动物模型中的作用，深入的探讨其作用机制，并使用抗体、药物等方式阻断关键性分子以开展治疗性研究。