动物毒素多肽类新药创制研究进展

高 瑞，姜 鸣,3，刘 霞，白占涛,3*

(1.延安大学生命科学学院；2.延安大学多肽资源药物研究中心；3.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000)

动物毒液产生于有毒动物的特殊腺体，是一种具有生物活性的复杂混合物，其成分取决于产生毒液的物种，传播途径多种多样，作用于目标动物身上，可以干扰正常生理或生化过程[1]。刺胞动物(海葵，海蜇等)、鞘类动物(章鱼，鱿鱼等)和节肢动物(蝎子，蜘蛛等)是最古老的毒液分泌谱系。近年来发现的有毒动物还包括鳞片类动物(蜥蜴和高级蛇)和锥形蜗牛[2]。动物毒液中的有毒成分主要是毒素蛋白质和多肽。动物毒素多肽根据其作用分为神经毒素、肌毒素、酶和引起疼痛的物质(如离子通道毒素等)。动物毒素多肽分子量相对其他毒素较小，具有较高的特异性和分子多样性，由基因直接编码，作用剂量小但毒性很强，是作用于目标生物体的关键生理成分[3-5]。因此，动物毒素多肽作为药物研发的天然资源被高度重视，大量动物毒素多肽来源药物被FDA批准上市，部分动物毒素多肽来源药物正处于临床试验阶段。

1 蛇毒素多肽药物

蛇毒是一种主要由酶和非酶蛋白/多肽组成的混合物，具有神经毒性、细胞毒性、心脏毒性、肌毒性和许多不同的酶活性，主要作用于具有高亲和力和选择性的离子通道、受体、转运体和酶[6]。来源于蛇毒素多肽的药物很多已经被应用于临床治疗[7]。

John Vane等人研究发现，从巴西蝮蛇Bothrops jaracaca毒液中提取的一种五肽化合物，是缓激肽的增强因子，对其结构进行裁剪和最小药效团Ala-Pro二肽修饰，合成了一种口服液肽“卡托普利”(Captopril)。卡托普利通过增加缓激肽活性和抑制凝血酶(ACE)来降低血压，是治疗高血压的常规药物。对卡托普利的结构修饰改造，依次开发了依那普利(Enalapril)、赖诺普利(Lisinopril)、雷米普利(Ramipril)、福辛普利(Fosinopril)等药物,结构参见图1所示[8]。在麟蝰蛇(Echiscarinatus)中发现的替罗非班(Tirofiban)是蝰蛇蛇毒蛋白肽模拟物，一种抗血小板药物，也称为糖蛋白IIb/IIIa抑制剂。另一种抗血小板药物埃替非巴肽(Eptifibatide)几乎同时与替罗非班上市，是一种合成的环七肽，模仿东南侏罗纪响尾蛇(Sistrurus miliariusbarbouri)毒液中发现的解整合素的作用。研究显示，急性冠脉综合征患者埃替非巴肽安全性略优于替洛非班，但疗效无显著差异[9]。来自眼镜蛇毒的口服抗凝剂Ximelagatran是一种维生素K拮抗剂，已在一些欧洲和南美国家获得批准，但FDA没有批准上市，原因是丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高可能导致该药物的肝毒性作用增强。因此，2006年该化合物的开发被叫停并从市场撤回[10]。来自绿曼巴蛇(Dendroaspis angusticeps)毒液的Cenderitide是第一个发现的毒素利钠肽(NP)，对中性内肽酶的降解具有抗性，初步临床数据表明Cenderitide改善了肾功能。用Cenderitide治疗心力衰竭的患者已完成了一系列I期和II期试验，但研究者担心该药的不良反应可能超过其获益[11]。从眼镜蛇蛇毒短链α-神经毒素中提取出来的Cobratoxin精制而成的克痛宁注射液和口服镇痛药“复方克痛宁(克洛曲片)”，具有镇痛效果强、药效时间长、成瘾性小等特点，作为高效镇痛药物已用于临床治疗多年[12]。近期研究显示，眼镜蛇神经毒素可以通过腺苷A1和A2受体产生中枢镇痛和高镇痛，镇痛作用强于吗啡[13]。此外，从台湾眼镜蛇蛇毒中分离的心脏毒素III(也称为细胞毒素III)可阻止MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移和侵袭而不会引起细胞凋亡或细胞周期停滞[14]。Hemocoagulase Agkistrodon是一种双链(29 kDa，252个氨基酸残基)蛇毒凝血酶(svTLE)，具有良好的止血活性，安全、副作用小，被中国列为国家一级药物(商品名Suling)，III期临床试验显示具有良好的凝血和止血功能[15]。

图1 临床应用的经化学修饰ACE抑制剂

1.Pentapeptide(五肽)，一种缓慢的底物，ACE抑制剂；2.Teprotide(九肽)，由Pentapeptide分离、合成；3.卡托普利(Captopril)，琥珀酰-Pro上添加巯基；4.依那普利(Enalaprilat),羧酸酯基取代巯基；5.赖诺普利(Lisinopril),乙醇酯化后添加赖氨酸；6.福辛普利(Fosinopril),含有次磷酸的前药；7.雷米普利(Ramipril),不含巯基的衍生物。

2 蝎毒素多肽药物

蝎子是我国传统中药的宝贵资源，中医认为它具有熄风镇痉，通络止痛，攻毒散结的功效，主要用于惊厥，癫痫，痉挛，中风，破伤风，癌症等疾病的诊断和治疗。蝎毒液，存在于蝎尾部毒腺组织内，成分复杂，包括神经毒素、细胞毒性肽、蛋白酶以及其它毒性成分，是一类具有多种生物活性的蛋白质或多肽的混合物[16]。蝎毒素多肽由20～80个氨基酸残基组成，分子量介于2.8～9kDa之间，分子内碱性氨基酸居多，作用于兴奋型细胞膜和 Na+、K+、Cl-、Ca2+等离子通道。其中短链蝎毒素多肽含有3对或4对二硫键，由29～39个氨基酸残基组成，主要作用于K+通道或者Cl-通道。长链蝎毒素多肽由60～70个氨基酸残基组成，含有4对二硫键，主要作用于Na+通道[17]。这些毒素与离子通道特异性结合能够阻断通道电流或使门控动力学发生改变，从而改变细胞膜的通透性。

蝎子Leiurusquinquestriatus毒液中发现氯毒素多肽在体外可延缓人脑胶质瘤细胞的活动[18]。委内瑞拉蝎Tityusdispans的毒液，具有抗菌和抗寄生虫活性，在体外可以抑制利什曼原虫的生长[16]。印度黑蝎的毒素蛋白Bengalin在体外能引起人类白血病细胞的凋亡以及雌性大鼠骨质疏松症生化指标的改善[19]。蝎毒液中发现的α-神经毒素可以延缓神经肌肉连接处钠通道的失活，而钠通道失活可能会增强神经肌肉的反射和气道收缩，理论上可以治疗睡眠呼吸暂停症[20]。蝎短链毒素(即氯毒素和氯毒素样肽)影响Cl-通道活性。从蝎毒中分离出来的CTX肽可与多种类型的肿瘤细胞特异性结合，广泛应用于癌症治疗，包括神经胶质瘤、脑肿瘤、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈部癌症和肉瘤等。BLZ-100是一种蝎氯毒素肽，它可与近红外荧光染料吲哚菁绿(ICG)共价结合来鉴定头颈部鳞状细胞癌和高危口腔发育不良[21]，在其他癌症的荧光鉴定中也被广泛应用[22]。

3 海葵毒素多肽药物

海葵，又名海菊花，属刺胞动物门、珊瑚虫纲、六放珊瑚亚纲、海葵目，是现存最古老的有毒动物纲之一。海葵与刺胞动物门的其他成员一样，具有许多特殊的刺细胞，广泛分布于全身[23]。这些带刺的细胞有一种被称为“线虫科”的细胞器，这种细胞器包含小的刺丝囊，含有一种复杂的毒素混合物，当机械刺激时，这些刺丝囊会被强有力地翻出，用于防御掠食性和捕食性动物[24]。海葵毒素主要由具有溶细胞或神经毒性的蛋白质和肽组成，包括电压门控Na+和K+通道毒素、酸敏感离子通道毒素、溶菌素、kunitz型蛋白酶抑制活性毒素和磷脂酶A2活性毒素，其效力随结构和作用部位不同而不同，并能有效地靶向不同动物，如昆虫、甲壳类动物和脊椎动物[25]。

从海葵中分离出来的ShK毒素是一种有效的Kv1.3通道阻滞剂，Kv1.3通道在人效应记忆T细胞的激活(增殖和细胞因子产生)中至关重要，ShK可治疗T细胞介导的自身免疫性疾病，例如多发性硬化和类风湿性关节炎[26]。Kv1.3受体阻滞剂也被认为是治疗肥胖的靶点，ShK毒素在治疗肥胖和胰岛素抗性中也具有潜在用途[27]。ShK-186是ShK毒素的类似物，现被称为Dalazatide药物，对Kv1.3的选择性比对Kv1.1、Kv1.4和Kv1.6提高了100倍，现在已经成功完成了临床试验，进入药品市场，用于治疗自身免疫性疾病[28]。

4 水蛭毒素多肽药物

水蛭，属环节动物门，蛭纲，是一种重要的中药，具有治疗脑出血和其他血栓相关疾病等多种作用[29]。水蛭的唾液腺中有一种有效的抗凝血剂——水蛭素。水蛭素是65个氨基酸残基的天然单链肽，分子量大约7.1 kDa，它的N端是球状的，具有3个链内二硫键和硫酸化酪氨酸残基，其C末端相当轻，具有许多带负电荷的氨基酸残基。水蛭素能抑制血栓的形成，阻止宿主血液凝固[30]。药理学研究表明，水蛭素具有抗凝、抗血栓、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗炎、改善血液流变学以及对脑缺血再灌注损伤的保护等功能[31]。

基于水蛭素的抗凝血剂包括重组水蛭素(Lepirudin和Desirudin)和水蛭素类似物比伐卢定(Bivalirudin)。Lepirudin被FDA批准用于治疗肝素相关性血小板减少症(HIT)和相关的血栓栓塞性疾病，但由于商业原因于2012年被撤销。Disirudin被FDA批准用于预防髋关节后的深静脉血栓栓塞(DVT)或进行膝关节成形术。Bivalirudin被FDA批准用于治疗经皮冠状动脉(PCI)介入治疗后不稳定性心绞痛，HIT或HIT风险升高。但这些凝血酶抑制剂的使用具有几个缺点，例如出血，对肾功能的强烈依赖，缺乏解毒剂和反弹高凝状态。因此，迫切需要开发高效且安全的抗凝血剂水蛭素衍生物[32]。

5 其他动物毒素多肽类药物

有毒动物种类多样，上述最典型的有毒动物毒素多肽的研究较多，在新药创制方面成果显著。除此之外，海洋锥形蜗牛(Conus)的毒液也作为新药开发有希望的来源，因为它们含有丰富多样的小肽，具有多种药理作用。来自海洋蜗牛Conus magus的MVIIA可以积极调节抗氧化系统和抗凋亡因子，被FDA批准用于治疗严重的慢性和神经性癌症疼痛[33]。齐考诺肽(Ziconotide)是一种独特的鞘内给药镇痛药，用于治疗慢性难治性疼痛。临床试验显示，齐考诺肽可有效治疗各种病因的疼痛，如单一疗法或辅助疗法[34]。Exendins是在Heloderma蜥蜴毒液中发现的激素样肽，Exendins-3和Exendins-4具有序列相似性(56%)，可作用于哺乳动物GLP-1受体表达生物学功能。艾塞那肽(Exenatide)是exendin-4合成物，已经被开发为一种抗糖尿病药物，亦可作为神经保护候选药物，用于治疗帕金森病[35]。在北美东部短尾鼩(the northern short tailed shrew)的唾液中发现一种麻痹肽Soricidin。SOR-C13是Soricidin的C系列肽，对TRPV6具有高亲和力和选择性，本身不具有麻痹性，但在体外研究中阻断了卵巢癌细胞的钙摄取，已经作为抗癌剂进入了I期临床试验[36]。

6 结语

大量动物毒素在分子生物学水平上的研究揭示，动物毒素多肽是当代创新药物的天然资源宝库。动物毒素对神经元离子通道、凝血酶、乙酰胆碱、血管紧张素等靶受体具有很高的亲和力和选择性，可以治疗高血压、多发性硬化、运动神经元、镇痛等疾病，是极有价值的药理学工具。目前,已经分离出大量具有生物活性的毒素多肽，这些肽为新药研发提供重要线索。尽管如此，但只有一小部分被批准用于临床阶段的评估，进入市场的则更少。其中一个重要原因可能是由于生物利用度低和与肽相关的稳定性的问题。使用具有较低分子量的有机化合物或短链肽来模拟肽的作用是克服这些问题的方法。此外，由于存在毒素的细胞毒性作用争论，已经使用一些新技术将这些动物毒素修饰为解毒版本，如毒素与聚合物材料(脂质体，微球，水凝胶和纳米颗粒等)的缀合用于靶向药物递送通常可以降低毒性，防止蛋白酶降解从而增强治疗效果。

综上，尽管仍有大量动物毒素还未被开发，但动物毒素多肽类药物在临床应用上已经取得的这些成就，让更多人意识到动物毒素多肽类药物研发的巨大潜力和前景。而许多动物毒素类药物在临床治疗的有效性，安全性等问题还有待进一步验证，因此以动物毒素为基础的药物研发同时也具有莫大的挑战。