两色金鸡菊提取物及其单体化合物体外抗凝血作用的研究

阿力腾布鲁克， 李琳琳， 王丽凤， 骆 新， 毛新民

(新疆医科大学1药学院； 2基础医学院； 3中医学院， 乌鲁木齐 830011)

两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt)为菊科(Compositae)金鸡菊属(Coreopsis)1年生草本植物，也被称为蛇目菊，原产于美洲[1]，在我国主要分布于新疆南疆地区海拔3 000 m左右的昆仑山区[2]。两色金鸡菊中含有氨基酸类、多糖类、多酚类、有机酸类、黄酮类、挥发油类等化学成分[3]，现代药理学研究发现其具有调节凝血功能、改善血脂、调节血糖、降低血压、促进胰岛素分泌及抗氧化等活性，临床上主要用于冠心病、高血脂、糖尿病等疾病的治疗[4]。许多危害人类健康的心脑血管疾病如脑血栓、心肌梗死等的发生、发展都与血栓的形成密切相关[5]，抑制血栓的形成，可从降低血小板功能、促进纤溶活性等多方面采取措施，而抗凝血是预防和治疗血栓疾病的一个重要手段[6]。本研究采用体外全血凝血实验和体外抗凝血活性实验，测定两色金鸡菊提取物及活性物质绿原酸、马里苷的抗凝血作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器TDL-5A型离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司)，XS205型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，HH-S4型恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)，STA-R Evolution全自动凝血分析仪(法国STAGO公司)、KQ-6LD型超声机(北京市光明医疗仪器有限公司)。

1.2试药0.9%生理盐水(西安京西双鹤药业有限公司，批号170224 2B)、活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂盒(法国STAGO公司)、凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(法国STAGO公司)、凝血酶时间(TT)测定试剂盒(上海太阳生物技术有限公司)。两色金鸡菊醇提物(ETE)、乙酸乙酯萃余物(AR)、醇提物纯化物(ETEP)、乙酸乙酯萃余物纯化物(ARP)(实验室自提)、绿原酸标准品(上海源叶生物科技有限公司，批号Y24J7K16726)、马里苷(法国中草药ES公司，批号ES0059S)、阿司匹林标准品(上海源叶生物科技有限公司，批号B21505)。健康人体血浆由实验室健康男性志愿者提供。

1.3药材两色金鸡菊2016年9月购买于新疆雪菊生物有限公司，经新疆医科大学中医学院毛新民教授鉴定为菊科金鸡菊属植物两色金鸡菊(CoreopsistinctoriaNutt)干燥的花。

1.4实验动物新西兰雄性大白兔，体质量(2.5±0.5)kg，由新疆医科大学动物实验中心提供，生产许可证号：SCXK(新)2016-0004；动物使用许可证：SYXK(新)2016-0001。

2 方法

2.1供试品的制备将两色金鸡菊干燥花序粉碎，用乙醇回流提取，滤液经减压浓缩、真空干燥得到ETE。将两色金鸡菊干燥花序，经乙醇回流提取，将提取液用经乙酸乙酯萃取，水相部分经真空干燥得到AR。将ETE、AR分别经大孔树脂HPD-100，以75%的乙醇洗脱纯化，收集洗脱液，旋转蒸发浓缩，浓缩液经真空干燥得到ETEP、ARP。

2.2全血凝血实验

2.2.1 样品溶液的配制 称取阿司匹林标准品，以0.9%生理盐水为溶剂，超声溶解5 min，即得阿司匹林(1.0 mg/mL)标准品溶液。以0.9%生理盐水为溶剂，将两色金鸡菊ETE、AR、ETEP、ARP提取物分别超声溶解15 min，配制成10.0 mg/mL的溶液，稀释成浓度分别为5.0 mg/mL和2.5 mg/mL的溶液，备用。

2.2.2 实验方法 取14支5 mL塑料试管，从家兔耳缘静脉取血，自血液进入真空采血管开始计时，用移液枪取1 mL置于5 mL塑料试管中，在各管血样中分别加入0.1 mL的 ETE、AR、ETEP、ARP(2.5、5.0、10.0 mg/mL)溶液、0.9%的生理盐水溶液、阿司匹林(1.0 mg/mL)溶液。迅速将试管放入37℃水浴加热，每隔30 s将试管倾斜，直至试管倒置血液不流动为止，记录凝血时间，即为CT值。每种样品测定5次，取平均值，以0.9%的生理盐水溶液为空白对照，以阿司匹林(1.0 mg/mL)为阳性对照。

2.3体外抗凝血活性实验

2.3.1 样品溶液的配制 称取阿司匹林标准品，以0.9%生理盐水为溶剂，超声溶解5 min，即得阿司匹林(1.045 mg/mL)标准品溶液；称取绿原酸标准品， 以0.9%的生理盐水为溶剂，温水浴溶解2 min，即得绿原酸(2.025 mg/mL)标准品溶液，倍比稀释得0.127、0.253、0.506、1.013 mg/mL的绿原酸标准品溶液；称取马里苷标准品，以0.9%生理盐水为溶剂，超声溶解5 min，即得马里苷(2.345 mg/mL)标准品溶液，倍比稀释得0.147、0.293、0.586、1.173 mg/mL的马里苷标准品溶液；称取两色金鸡菊ETE、AR、ETEP、ARP提取物，以0.9%的生理盐水为溶剂，分别超声溶解15 min，即得ETE、AR、ETEP、ARP(9.975、9.980、9.990、9.990 mg/mL)溶液，倍比稀释得ETE(1.247、2.494、4.988 mg/mL)、AR(1.248、2.495、4.990 mg/mL)、ETEP(1.253、2.505、5.010 mg/mL)、ARP(1.249、2.498、4.995 mg/mL)溶液，备用。

2.3.2 人体血浆的制备 健康男性志愿者，用3.8%枸橼酸钠抗凝管静脉采血，以3 000 r/min离心10 min，收集上层液体血浆，得到乏血小板血浆(PPP)，分装于1.5 mL塑料管中，置于-20℃冰箱保存，保存时间不超过2 w，临用前37℃水浴解冻。

2.3.3 实验方法 取“2.3.1”项下样品溶液和“2.3.2”项下血浆按1∶9的体积比混合，混合血浆37℃孵育5 min，按照试剂盒和仪器的操作说明上机测定APTT、PT、TT 3个指标，以阿司匹林标准品和0.9%的生理盐水作为待测样品的阳性和空白对照，每组平行测定3次。

3 结果

3.1全凝血活性实验结果与空白对照组比较，阳性对照组、ETEP组(10.0 mg/mL)CT值延长，差异有统计学意义(P<0.01)；ARP组(2.5 mg/mL)CT值缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。与阳性对照组比较，ETEP组(10.0 mg/mL)CT值延长，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

3.2体外凝血活性实验与空白对照组比较，阳性对照组、ETE组(4.988 mg/mL)、绿原酸组(0.127、0.253、0.506、1.013、2.025 mg/mL)、马里苷组(0.147、1.173、2.345 mg/mL)APTT值延长，差异有统计学意义(P<0.01)；与阳性对照组比较，绿原酸组(0.127、0.506、1.013、2.025 mg/mL)、马里苷组(1.173 mg/mL)APTT 值延长，但不具浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组比较，ETE(1.247、2.494、4.988、9.975 mg/mL)、AR(2.495、4.990、9.980 mg/mL)、ARP(1.249、4.995、9.990 mg/mL)、绿原酸(0.127、0.253、0.506、1.013、2.025 mg/mL)、马里苷(1.173 mg/mL) PT值延长，差异有统计学意义(P<0.01)；与阳性对照组比较，ETE组(4.988、9.975 mg/mL)PT值延长，差异有统计学意义(P<0.01)。与空白组对照，ETE组(1.247 mg/mL)、AR组(1.248 mg/mL)、ETEP组(1.253 mg/mL)、ARP(1.249、2.498、4.995 mg/mL)APTT值缩短，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表1 两色金鸡菊各提取物对新西兰兔凝血时间的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01； 与阳性对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

4 讨论

凝血途径包括内源和外源凝血途径[7]，外源凝血途径主要由于组织因子释放,通过激活凝血因子Ⅶ并与之形成复合物进而激活凝血因子Ⅹ,并可激活凝血因子Ⅸ而促进内源凝血过程[8]；内源凝血途径是指血液在血管外与异物表面接触时触发的凝血过程[9]。APTT、PT和TT是各自独立的基础性凝血途径筛查指标。APTT 是用来检测内源性凝血途径中的Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ和激肽释放酶原。PT 是检测外源性凝血途径[10]。除ETE、绿原酸、马里苷能抑制内源性凝血酶活性外，其他提取物不抑制内源性凝血酶活性；所有受试样品能不同程度的抑制外源性凝血酶活性。提示两色金鸡菊可能通过外源性凝血酶途径达到抗凝血作用，对内源性凝血酶途径也有一定影响，绿原酸和马里苷是其抗凝血作用的活性成分。

表2 各样品对人APTT、PT和TT的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01； 与阳性对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。

在本研究发现两色金鸡菊高浓度ETEP有较好的抗凝血作用，提示两色金鸡菊ETEP可能是其抗凝血作用的有效部位，但其促进内源性凝血酶活性和外源性凝血酶活性抑制作用表现不及ETE，推测两色金鸡菊还可以通过其他途径达到抗凝血作用。血小板是一期止血的基础，可为凝血系统活化及凝血酶的最终形成提供磷脂表面，而在血液凝固中起着重要的作用[11]。ETEP中富含有机酸类和黄酮类成分[12]，如绿原酸、异绿原酸、槲皮素等[13-15]，推测两色金鸡菊可能通过抑制血小板聚集、影响血小板活化而起到抗凝血作用。本实验研究表明两色金鸡菊是通过多种物质、多作用靶点达到抗凝血作用。