星点设计-响应面法优化意大利牛舌草总皂苷提取工艺

万琪臻， 张文文， 滕 亮， 马桂芝

(1新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011； 2新疆医科大学第一附属医院药学部, 乌鲁木齐 830054)

意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)为紫草科多年生草本植物[1-2]，主要含有皂苷、黄酮、生物碱等成分[3-4]，具有抗炎、抗溃疡、抗氧化、抗流感病毒、抗癌等药理作用[5-8]，对心脑血管疾病具有良好的治疗作用[9]。本课题组前期研究表明意大利牛舌草具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用。本研究以单因素试验为基础，采用星点设计-响应面法(central composite design，CCD)优选意大利牛舌草总皂苷提取工艺，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器AB135-S型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)，UV-2700型紫外分光光度仪(日本岛津公司)，KQ-500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器公司)，RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，WLY-200型高速多功能粉碎机(上海梦祥电器有限公司)，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，HH-S4型数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)，HHS21-6电热恒温水浴锅(上海琅玕实验设备有限公司)。

1.2试药齐墩果酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号HA0820KA14)，无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20170701)，甲醇(天津市百世化工有限公司，批号20120402)，冰乙酸(天津市富宇精细化工有限公司，批号120920)，香草醛(天津市光复精细化工研究所，批号20130712)，高氯酸(天津市鑫源化工有限公司，批号20140909)，高氯酸(天津市政成化学制品有限公司，批号20180401)，蒸馏水(实验室自制)，试剂均为分析纯。

1.3药材意大利牛舌草2018年4月购于新疆伊鼎辉煌生物有限公司，经由新疆医科大学药学院帕丽达·阿布力孜教授鉴定为紫草科(Boraginaceae)多年生草本植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz.)的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的制备称取齐墩果酸对照品适量于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成浓度为0.12 mg/mL的对照品溶液，备用。

2.2供试品溶液的制备称取意大利牛舌草粉末(过40目筛)5.0 g，置于圆底烧瓶中，加80%乙醇60 mL，80℃回流提取，滤过，量取0.1 mL滤液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，备用。

2.3标准曲线的制备分别吸取“2.1”项下对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，量取对照品溶液1 mL，置于具塞试管中，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，70℃反应15 min，冰浴冷却2 min后加入冰乙酸5 mL，摇匀，于547 nm处测定吸光度。以对照品浓度(X)为横坐标、吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.009 7X+0.021(r=0.999 5)，在7.22～65.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.4单因素试验

2.4.1 乙醇浓度对意大利牛舌草总皂苷提取含量的影响 称取牛舌草粉末(过40目筛)5份，每份5.0 g，置于圆底烧瓶中，分别加入100%、95%、80%、60%、40%乙醇60 mL于80℃回流1 h，滤过，分别量取 0.1 mL药液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”项下方法测定样品中总皂苷的含量。当乙醇浓度为80%时，提取液中意大利牛舌草总皂苷含量达到最大值，故选择80 %乙醇为提取溶剂，见图1 A。

2.4.2 液料比对意大利牛舌草总皂苷提取含量的影响 称牛舌草粉末(过40目筛)5份，每份5.0 g，置于圆底烧瓶中，用80%乙醇按液料比为4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1(mL∶g)于80℃回流1 h，滤过，分别量取0.1 mL滤液于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”项下测定样品中总皂苷的含量。当液料比为12∶1时，提取液中意大利牛舌草总皂苷含量达到最大值，故选择液料比为12∶1，见图1B。

2.4.3 提取时间对意大利牛舌草总皂苷提取含量的影响 称牛舌草粉末(过40目筛)5份，每份5.0 g，置于圆底烧瓶中，用80%的乙醇60 mL于80℃分别回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，滤过，分别量取 0.1 mL滤液于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”项下测定样品中总皂苷的含量。当回流1 h时，提取液中意大利牛舌草总皂苷含量达到最大值，故选择1 h为最佳回流时间，见图1 C。

2.4.4 提取次数对意大利牛舌草总皂苷提取含量的影响 称取牛舌草粉末(过40目筛)3份，每份5.0 g，置于圆底烧瓶中，加入12倍量80%的乙醇于80℃回流1 h，分别回流1、2、3次，滤过，分别量取 0.1 mL滤液于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，按“2.3”项下测定样品中总皂苷的含量。当提取次数为2次时，提取液中意大利牛舌草总皂苷的含量高于提取1次，提取3次与提取2次，意大利牛舌草提取液中总皂苷含量无明显差异，故选择2次为最佳提取次数，见图1D。

2.5星点设计-响应面法优化意大利牛舌草总皂苷提取工艺

2.5.1 试验设计 在单因素试验的基础上采用星点设计-响应面法优化意大利牛舌草总皂苷提取工艺。根据单因素试验结果确定乙醇浓度(A)、液料比(B)作为星点设计考察因素，星点设计-响应面法的因素水平，见表1。

乙醇体积分数/% 液料比/(mL∶g) 提取时间/h 提取次数/次

图1 各因素对意大利牛舌草总皂苷提取含量的影响

2.5.2 模型的建立和方差分析结果 采用Design Expert 8.06软件对试验结果进行方差分析和多元二次回归拟合，得到的回归方程：Y=197.21-0.17A+21.27B+ 3.38AB-57.76A2-14.26B2，模型极显著(P<0.01)，模型R2=0. 999 3，调整R2(Adj)=0.998 9表明该模型能解释99.93%响应值变化，即该模型与实际试验拟合较好，失拟相P=0.068 2>0.05，不显著，见表2。

表2 意大利牛舌草总皂苷含量回归方程方差分析结果

2.5.3 响应面分析结果 由等高线图及响应面图可直观了解各因素之间两两交互作用对总皂苷提取效果的影响。当液料比不变，随着乙醇浓度的增加，总皂苷的含量先增加后降低；乙醇浓度不变，随着液料比的增加，总皂苷的含量增加缓慢。沿液料比方向的等高线密度变化相对乙醇浓度方向高，说明液料比对总皂苷的提取影响大于乙醇浓度。比较各因素的F值也可知各因素试验结果影响的大小顺序为：B>A，即液料比>乙醇浓度。经响应面设计分析，意大利牛舌草总皂苷较优提取条件为：14倍量80%乙醇，80℃回流提取2次，每次30 min，预测总皂苷含量为205.16 mg/g，见表3、图2、3。

表3 响应面分析试验结果(n=13)

2.6验证试验称牛舌草粉末(过40目筛)3份，每份5.0 g，置于圆底烧瓶中，加80 %乙醇70 mL，回流提取2次，每次30 min，过滤，按“2.3”项下方法测定样品中总皂苷含量分别为：201.53、203.42、204.17 mg/g，平均含量为(203.04±1.36)mg/g(RSD=0.67%)，与预测值之间的相对误差为1.04%，表明所建立的模型具有良好的预测性。

3 讨论

星点设计-响应面法是优选制备工艺的常用方法[10-13]，采用非线性数学模型进行拟合，复合相关系数较高，且在中心点进行重现性试验以提高试验精度，与优选制备工艺的常用方法-正交设计法和均匀设计法相比，试验精度更高，预测值更接近真实值，且操作简便、试验次数也较少，在试验设计中更具优势[14-15]。

本研究单因素试验结果提示乙醇浓度、液料比对意大利牛舌草总皂苷的提取含量有较为显著的影响，乙醇浓度的影响大于液料对总皂苷含量的影响。星点设计-响应面法的结显提示对意大利总皂苷提取含量的影响液料比>乙醇体积分数，存在这种差异主要是因为单因素试验中假定各因素之间为独立因素，不存在交互作用，而星点设计-响应面法则考虑到了各因素间可能存在的交互作用，星点设计-响应面法方差分析亦表明液料比与乙醇浓度的交互作用极显著，说明液料比与乙醇浓度存在交互作用。同时星点设计-响应面法优选工艺所得意大利牛舌草总皂苷提取量高于单因素试验所得意大利牛舌草总皂苷提取量的最大值，亦验证了星点设计-响应面法可用来分析各因素对意大利牛舌草总皂苷提取工艺的影响，该方法准确、可行、预测性好。