小麦发芽过程中酚类物质及其抗氧化活性的变化

金舟，徐颖，王敏，王津，王莎莎，刘零怡,2*，沈汪洋,2，刘连亮

1(武汉轻工大学 食品科学与工程学院，湖北 武汉，430000) 2(大宗粮油精深加工省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉，430000) 3(宁波大学 食品与药学学院，浙江 宁波，315800)

小麦(TriticumaestivumL.)是三大谷物之一，2010年小麦成为世界上总产量位居第二的粮食作物(6.51亿t)，仅次于玉米(8.44亿t)[1]。小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、硫胺素、核黄素、烟酸及维生素A等[2]。小麦成熟和收获的季节通常伴随着潮湿多雨的天气，导致大量小麦发芽，从而影响小麦的品质[1，3-4]。然而，文献资料表明，发芽小麦具有抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、增强免疫力、延缓衰老、降胆固醇、降血脂、降血糖等功能[5]。发芽过程中小麦会形成多种生理活性物质，如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)[6]，它是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质[7]。

目前对发芽小麦中活性成分的研究主要集中于发芽小麦γ-氨基丁酸的富集、提取和应用[8-9]，而对其中的酚类化合物关注较少。本研究以扶麦1228为实验材料，研究小麦发芽过程中酚类化合物(酚酸和黄酮)种类及含量的变化，比较发芽时间对其影响，并探讨这一过程的抗氧化活性变化，为发芽小麦深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：小麦(扶麦1228，产自湖北省，市售)，甲醇(HPLC级纯度，产自TEDIA)，乙腈(HPLC级纯度，产自TEDIA)，2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ，分析纯)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，分析纯)，2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS，分析纯)，蒸馏水，其他分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

人工气候培养箱，亿恒科技有限公司；烘箱，上海精宏实验设备有限公司；万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；紫外分光光度计(UV-1800PC),MAPADA；低速离心机(SC-3612)，中佳；纯水机，优普特；超声波清洗机(SB-5200DTN)，宁波新芝生物科技股份有限公司；数显恒温水浴锅(HH-Z)，国华电器有限公司；万分之一电子天平(LE204E)，Mettler Toledo；UPLC,美国Waters。

1.3 试验方法

1.3.1 不同发芽时间发芽小麦的制备

随机选取20粒小麦种子，测得平均粒长为(0.71±0.03)cm。按照《GB/T 5520—2011 粮油检验籽粒发芽试验的方法》制备不同发芽时间的发芽小麦，按照0、2、5、8和11 d的发芽时间使小麦发芽。将发芽好的小麦放到50 ℃的热风干燥箱里面烘10 h，然后将烘干的发芽小麦放进万能粉碎机里面粉碎2 min，得固体粉末待用。

1.3.2 样品提取方法

称取粉碎好的不同发芽时间样品粉末各0.5 g于25 mL锥形瓶中，按照1∶20(g∶mL)料液比添加体积分数为60 %甲醇溶液。将样品放在超声波清洗机中以60℃温度下超声90 min[10]。超声完毕后，将提取液放入15 mL离心管中以2 194×g离心25 min，取上清液，放入4℃冰箱贮藏[11]。

1.3.3 总酚含量的测定

准确称取没食子酸对照品10 mg，用超纯水溶解并定容到10 mL，质量浓度为1 mg/mL。吸取没食子酸对照液0、0.04、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56 mL于10 mL容量瓶并用体积分数为60%的甲醇溶液定容。各加入1.0 mL福林试剂和2.0 mL质量浓度200 g/L Na2CO3水溶液，(50±1)℃恒温水浴中加热30 min后，用水冷却并稀释至25 mL。室温放置30 min，在1 cm比色杯测定745 nm处吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。取1 mL的待测液，按标准曲线制备的步骤，于745 nm处进行吸光度的测定。

1.3.4 总黄酮含量的测定

准确吸取芦丁标准溶液 0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，相当于芦丁0、75、150、300、450、600 μg移入10 mL刻度比色管中，加入体积分数为30%的乙醇溶液至5 mL，各加5 g/L NaNO2溶液0.3 mL，振摇后放置5 min，加入10 g/L Al(NO3)3溶液0.3 mL摇匀后放置6 min，加1.0 mol/L NaOH溶液2 mL，用体积分数为30%的乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1 cm的比色杯在510 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线或求取线性回归方程[12]。根据标准曲线计算出试样的黄酮含量。

1.3.5 超高效液相检测酚类化合物种类及含量

UPLC分析条件为：Thermo色谱柱Hypersil Gold(150 mm×2.1 mm，1.9 μm)；进样量1 μL；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃，PDA检测波长为280 nm；流动相A为甲醇和乙腈等比例混合的溶液，流动相B为体积分数2.5%的乙酸溶液，超高效液相色谱梯度洗脱条件为：0～6 min，20%A；6～15 min，40%A；15～18 min，70%A；18～24 min，5%A[13]。以没食子酸、咖啡酸、羟基酪醇、香草醛、对羟基苯甲酸、绿原酸、芹菜素、没食子酸、阿魏酸、芦丁、对香豆酸、木犀草素为标准品绘制标准曲线，以保留时间定性、峰面积定量检测不同发芽时间发芽小麦中上述酚类化合物的含量。

1.3.6 发芽小麦抗氧化能力的测定

1.3.6.1 ABTS法测定发芽小麦抗氧化能力

ABTS液的配制：将176 μL 140 mmol/L的过硫酸钾溶液和10 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液混合，避光静置12～16 h，形成ABTS+·储备液。用无水乙醇将ABTS+·溶液稀释至吸光值为0.700±0.02(734 nm波长下)，贮存于棕色瓶内备用[14]。取待测样溶液0.1 mL和 3.9 mL ABTS+·溶液混合摇匀，室温下反应6 min,在734 nm波长下测定吸光值As；同时测定0.1 mL样品提取、稀释溶剂(蒸馏水)和3.9 mL ABTS+·溶液的吸光度A0，以及0.1 mL待测样溶液和3.9 mL ABTS+·溶液的溶剂(无水乙醇)吸光度Ar，阳性对照为维生素C(VC)。

1.3.6.2 发芽小麦中DPPH清除率

准确称取DPPH试剂20 mg，用无水乙醇定容至500 mL容量瓶中，摇匀贮存于棕色瓶中备用。取待测样溶液0.2 mL(所用测试样品均溶解在蒸馏水中)和3.8 mL DPPH溶液混合摇匀，室温下反应1 h，在517 nm波长下测定吸光度As；同时测定DPPH溶液与等体积(0.2 mL)蒸馏水的吸光度A0，以及0.2 mL待测样溶液与3.8 mL DPPH溶液的溶剂(无水乙醇)吸光度Ar，阳性对照为Trolox[14-15]。

1.3.6.3 发芽小麦FRAP值的测定

以10∶1∶1体积比混合300 mmol/L醋酸缓冲液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液。吸取100 μL系列浓度为200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 μmol/L的FeSO4溶液，与3.9 mL FRAP溶液混合，在37 ℃水浴中反应10 min，于593 nm下读取吸光值，以FeSO4溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线[14,16]。吸取100 μL待测样品，与3.9 mL FRAP溶液混合，在37 ℃水浴中反应10 min，于593 nm下读取吸光值，并在标准曲线上获得待测样品相应的硫酸亚铁浓度，定义为当量浓度(FRAP值)。

1.4 数据处理方法

本文数据处理采用SPSS 24进行显著性分析，Origin 2017和Excel 2010等图表制作软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同发芽时间小麦总酚和总黄酮含量的变化

根据发芽小麦发芽时间和芽长，分为15组样品，具体如表1所示。

表1 样品信息Table 1 Samples information

图1为不同发芽时间小麦中总酚和总黄酮含量的变化。未发芽小麦(空白)总酚含量为(1.36±0.12)%。随着发芽时间延长，总酚含量持续增加。总酚含量在第8天达到峰值，之后略有下降，但并无

图1 不同发芽时间小麦总酚和总黄酮含量变化Fig.1 Changes of total phenols and total flavonoids in wheat with different germination time

显著差异(P>0.05);总黄酮含量在第11天达到峰值。同时，随着发芽时间的增加，麦粒变得干瘪，第11天干瘪程度最大。

2.2 发芽小麦多酚种类和含量的测定

采用UPLC法检测不同发芽时间下小麦中的酚类化合物(表2)，可以看出，随着发芽时间的增加，小麦中酚类化合物的含量总体上呈上升的趋势，酚类物质的种类也增加，均高于未发芽小麦。在8～11 d达到最高。

表2 不同发芽时间下小麦中酚类化合物的含量 单位：μg/g

2.3 发芽小麦的抗氧化活性

从图2可以看出，随着发芽时间的延长，发芽小麦中活性物质的抗氧化活性不断增强，发芽和未发芽小麦之间DPPH和ABTS抑制率以及铁离子还原力(FRAP)的差异非常显著(P< 0.01)。随着发芽时间的延长，小麦中的活性物质对ABTS、 DPPH的抑制能力和铁离子还原力均逐渐增强，对比小麦发芽过程中酚类化合物含量和成分的变化，这可能是发芽小麦中阿魏酸，咖啡酸，芦丁等活性物质的含量有显著提高(P<0.05)，导致发芽小麦抗氧化活性增强[17]。

A-DPPH%清除率；B-ABTS%清除率；C-FRAP值图2 发芽小麦样品的抗氧化活性测定Fig.2 Antioxidant capacities of germinated wheat samples

3 结论

本文研究了发芽小麦中酚类化合物的种类与含量，进一步研究发芽小麦抗氧化活性强弱。根据总酚含量、总黄酮含量、抗氧化活性数据可知，长时间的发芽能够增加发芽小麦内酚和抗氧化能力。与未发芽小麦相比，发芽小麦总酚含量更高，酚类化合物种类更加多样，抗氧化活性更强。因此发芽小麦可以作为一种潜在的天然抗氧化剂来源，为绿色健康食品的加工提供参考。