一种G蛋白偶联受体-趋化因子受体的表达方法

寻 阳，吴馥凌，崔蒙蒙，陈玫仰，李捷凯，刘 芳

（佛山科学技术学院口腔医学院，广东佛山528000）

趋化因子是一种能够趋化细胞使其定向移动的细胞因子，与其相应受体结合能激发细胞内信号通路，引起一系列细胞微环境变化，广泛参与机体的生理与病理过程，与炎症反应、免疫防御等重要的机体功能密切相关［1］。

趋化因子受体是7次跨膜G蛋白偶联受体（GPCR）。根据分子氨基端的半胱氨酸残基排列顺序的不同，趋化因子受体可分为CXCR，CCR，CR和CX3CR 4个亚型［2-3］。当与趋化因子配体结合时，通过受体胞内G蛋白结构变化，将胞外信息传递到胞内［4］，参与调控细胞的生长、分化、凋亡、组织损伤等各种病理和生理过程［5］，不同亚型的趋化因子受体在人体中扮演着不同角色。近年来，趋化因子受体在肿瘤中的角色受到诸多关注，如CCR7影响肿瘤细胞生长及向淋巴结的转移［6］；CX3CR1在大肠癌中有表达且影响其转归［7］；CCL2/CCR2信号通路可参与CDb/Gr髓源细胞的数量变化，影响肿瘤负荷［8］；CCL20/CCR6影响喉癌细胞系及癌组织的增殖和转移［9］等。为深入研究趋化因子受体在不同肿瘤中的作用，对其分子结构的破解意义重大。随着2010年及2014年CXCR家族中CXCR1和CXCR4的结构问世及其相应靶向药物的研发［10-11］，趋化因子受体的结构研究备受瞩目。然而，由于受到其7次跨膜结构的影响，其表达相较于一般蛋白更具挑战。常用于GPCR的生物表达系统为大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫表达系统。本研究将针对这3种表达系统对趋化因子受体的表达方法进行综述。

1 大肠杆菌表达系统

在异源表达蛋白的宿主中，大肠杆菌是最为常用的宿主。然而，作为跨膜型蛋白，趋化因子受体在大肠杆菌中表达时，由于表达系统差异性容易发生错误折叠亦或形成包涵体［12］。另一方面，外源膜蛋白的过量表达时常会导致细胞毒性［12］，降低细菌的生物量，从而减少目标蛋白的表达［13］。因此，在构建大肠杆菌表达系统时，常见的方法为使趋化因子受体以融合蛋白的形式进行表达。例如，硫氧还（thioredoxin）蛋白的融合蛋白能够帮助重组趋化因子受体CCR5、CX3CR1等形成二硫键，以增加蛋白的稳定性［14-15］，但其生物活性和表达量仍缺乏进一步研究。融合蛋白的使用在表达趋化因子受体外的GPCR中也十分常见，如利用GPCR-Gα融合蛋白表达孤儿G蛋白偶联受体（oGPCR）［16］，毒蕈碱型乙酰胆碱受体(MACHR)M3-G11α融合蛋白用于研究偶联受体M3等［17］。此外，提高膜蛋白的水溶性［18］可保证趋化因子受体的活性，如利用麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein（MBP））帮助膜蛋白正确折叠并使之嵌入细菌的细胞膜上［19-21］。2016年，CCR3以融合MBP生成MBP-CCR3的形式被成功表达［22］。

在大肠杆菌内表达趋化因子受体受到多种因素影响，如受体菌、培养基、诱导时机、表面活性剂等。在受体菌方面，筛选出能够较好地表达外源蛋白并同时对蛋白过度表达产生的毒性有较大容忍性的细菌体至关重要。研究发现利用大肠杆菌TB1表达CCR3时的表达量明显高于BL21和Top10［22］；利用BL21无法正常表达CCR5、CXCR4以及CX3CR1等受体［23］。除此之外，培养基的选择也对趋化因子受体的表达［24］发挥重要作用。常用培养基包括LB、TB和2YT等。相较于LB和2YT，TB培养基含有更多的胰蛋白胨和酵母提取物，且具有较强的缓冲能力，可有效地稳定培养基pH值。研究显示，CCR3在TB培养基中表达量是在其他两种培养基中表达量的10倍［22］。不仅如此，诱导时机对提高趋化因子受体在大肠杆菌内的表达亦十分关键。研究显示，在可溶性GST-CRH在大肠杆菌表达中，OD600为0.8时为可溶性GST-CRH表达的最佳诱导时机［25］，低于或高于0.8值时表达量降低。对于有毒性的蛋白或膜蛋白的表达，较晚的诱导通常可以得到较高的表达量，这是由于蛋白毒性可能抑制宿主菌生长、造成细菌密度降低［26］。表达 CCR3的最佳诱导时机为 OD600=0.6［22］，而表达 CCR5及 CXCR4时诱导值低于 0.6，可能说明CCR3对细菌的毒性小于CCR5和CXCR4［27］。最后，表面活性剂在趋化因子受体研究的后期纯化、和结晶中扮演重要角色，筛选适合的表面活性剂除了具有增溶作用［28］还能保持目标蛋白的稳定和溶液中的单体状态［29-30］。

趋化因子受体在大肠杆菌内的表达需要精心设计，在菌种选择、培养基选择、诱导剂时机、表面活性剂条件上需要进行大量实验摸索，筛选出最佳表达方案。然而，由于大肠杆菌是原核细胞表达系统，缺乏翻译后修饰以及可能存在错误折叠等因素导致制备出的蛋白不具有生物学活性［31-32］，因此，时常需要运用其他的具备完整的表达系统，能够完成整个蛋白表达过程的真核细胞表达体系。

2 哺乳动物细胞表达系统

选择哺乳动物细胞表达系统能够避免上述在大肠杆菌内出现的诸如蛋白结构错误、失去生物活性等问题。哺乳动物细胞表达系统具有相对较完整的表达机制，能够完成翻译后的修饰，获得空间结构完整的蛋白［33］。

利用哺乳动物系统表达趋化因子受体首先应确定诱导条件，包括诱导剂的选择、诱导剂浓度、诱导时间等。常用于GPCR蛋白表达的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、四环素等。以趋化因子受体CCR3为例［22］，不加诱导剂时，几乎不表达；加入2 μg/mL四环素和5 mmol丁酸钠诱导48 h后表达量明显提高；不仅如此，改变四环素和丁酸钠的比例对CCR3的表达量亦有影响。其次，由于受到趋化因子受体跨膜结构的影响，蛋白在水溶液中容易聚集变性，需要表面活性剂的增溶。与大肠杆菌表达系统系统相似，合适的表面活性剂或其混合物能够提高表达量和提取率，同时稳定蛋白活性。不同的趋化因子受体有其对应的不同的表面活性剂，同一表面活性剂对不同趋化因子受体也有不同的影响。比如，Cymal 5能够对趋化因子受体CCR5进行增溶和稳定，但是对CXCR4的增溶效果不明显［34-35］。因此，针对不同的趋化因子受体需要分别进行实验探索，获得最佳的表面化学剂实验条件。

与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞系能够对表达出的趋化因子受体进行修饰，如对末端进行磷酸化、甲基化、糖基化等，形成完整的空间结构，实现蛋白质的正确折叠和功能有重要作用［36-38］。特别是对于趋化因子受体而言，七次跨膜的复杂结构在维持其特殊功能具有重要的作用，包括配体识别、信号传导等一系列生物学反应。

3 昆虫细胞表达系统

许多GPCR都是用杆状病毒-昆虫细胞系统进行表达［39］，其表达水平高于哺乳动物细胞表达系统，且能对受体进行修饰。常用的昆虫细胞系有Sf9和Sf21［40］。

利用昆虫细胞表达系统表达趋化因子受体时可以通过在培养基中添加不同趋化因子配体来影响受体的表达水平，例如，在Sf9系统中表达CXCR4以解析其分子结构时，为了稳定CXCR4的结构，在表达系统中加入了配体CXCL12，CXCL12二聚体与CXCR4-N端连接［41］，另外，加入小分子拮抗剂IT1t和CVX15也可有效稳定CXCR4的结构从而达到适用于蛋白结晶的表达量［42］；在Sf9系统中表达M2受体时，发现加入拮抗剂阿托品可增加蛋白的表达量，加入激动剂乙酰胆碱或哌仑西平则降低其表达量［40］；在构建昆虫表达系统时，也常以融合蛋白的形式进行趋化因子受体表达，例如，在昆虫表达系统中表达CXCR4时加入了T4 lysozyme融合蛋白以促进CXCR4晶体的生成［43-44］。

与哺乳动物相比，昆虫细胞表达系统可高效表达受体，每升感染的细胞可表达1～500 mg的受体［45］，且更易研究GPCR的G-protein选择性［46］，但受体在该系统中糖基化程度较低且形式单一［47］。

4 小结

综上所述，趋化因子受体的表达重点在于保证趋化因子受体的结构稳定前提下，提高其表达量，然而，作为含有7次跨膜疏水α螺旋结构的GPCR，除了制备过程比较困难外，同时还需要尽可能地保留其生物活性。因此，趋化因子受体的表达方法的研究存在一定难度。其表达是其解析分子结构的基础。本文通过对趋化因子表达方法进行总结归纳，为相关基础性研究提供参考依据。