陈年乌龙茶的生化成分及其降脂降糖活性研究

霍梦恩，李冬利，罗小燕，安 然，文 帅，赖幸菲，孙世利*

（1.五邑大学生物科技与大健康学院，广东江门 529020；2.广东省农业科学院 茶叶研究所，广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东广州 510640；3.广东中艺职业培训学院，广东广州 510520）

茶对人体具有广泛的益处[1]，且具有独特的风味品质，深受人们喜爱。茶叶经过合理的储存与陈化，其感官品质与内含成分与新茶相比有质的变化[2-3]。近年来，有关陈年茶的研究主要集中在黑茶和绿茶，且主要研究其感官品质和生化成分变化[4-10]。有关陈年乌龙茶的生化成分及其体外抗氧化活性等的研究少有报道。本文以三个茶树品种的1990年和2016年的乌龙茶为研究对象，分别测定和比较分析其生化成分含量及其体外抗氧化与抑制α-淀粉酶和胰脂肪酶的活性，同时采用灰度关联分析法分析其生化成分与抗氧化活性、抑制α-淀粉酶和胰脂肪酶的活性关联度，以期为陈年乌龙茶的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

1990年和2016年的黄金桂、岭头单丛和大叶奇兰乌龙茶，茶样密封后置于干燥、无异味、阴凉处保存。

1.1.2 试剂

没食子酸（GA）、儿茶素（C）、没食子儿茶素（GC）、儿茶素没食子酸酯（CG）、没食子酸儿茶素没食子酸酯（GCG）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）均购自Sigma公司。咖啡碱（CAF）购自上海源叶生物技术有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：德国Merck公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；ZMQS5001型Millipore纯水仪，密理博（Millipore）公司；HHS型恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；OHAUS准微量电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；752N紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 主要生化成分测定

水分测定：GB 5009.3-2016；水浸出物含量测定：GB/T8305-2013；茶多酚含量测定：GB/T 8313-2018；氨基酸含量测定：GB/T 8314-2013；可溶性糖含量测定：蒽酮-硫酸比色法。

1.3.2 儿茶素、没食子酸和咖啡碱测定

茶汤浸提：准确称取各茶叶磨碎样1.5 g，置于三角烧瓶中，加入沸腾的蒸馏水225 mL，置于沸水浴锅中浸提45 min，中间搅拌2～3次，浸提完毕后趁热抽滤，滤液转入250 mL容量瓶中，冷却后加蒸馏水定容。

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，150 mm×4.6 mm；检测波长280 nm，检测温度28℃；流动相A：含0.5%乙酸、1%乙腈和2%甲醇的水溶液；流动相B：含0.5%乙酸、10%乙腈和20%甲醇的水溶液；洗脱步骤：在30 min内，A相由72.5%到20%，B相由27.5%到80%，30 min后在5 min内，A相由20%恢复到72.5%，B相由80%恢复到27.5%，流速1.0 mL/min，进样量为 10 μL，（B相由 80%到27.5%之后，一直持续到40 min）。以外标法按峰面积进行定量。

1.3.3 体外活性测定

茶叶水浸提物的制备：称取适量的陈年乌龙茶按茶水比1:20在90℃下浸提0.5 h，然后趁热过滤并收集滤液，重复三次。对收集的滤液进行旋蒸浓缩，然后进行冷冻干燥得到乌龙茶浸提物的冻干粉，干燥保存。

茶叶的总抗氧化能力测定：采用FRAP法，具体操作步骤参考向丽敏等[4]的方法。

体外抑制α-淀粉酶活性的测定：取0.3 mL α-淀粉酶液于试管中，分别加入0.3 mL不同稀释倍数的待测样品，混匀后放入37℃恒温水浴锅中水浴8 min，然后加入0.3 mL预热至37℃的1%可溶性淀粉，37℃水浴反应10 min后加入0.3 mL DNS显色剂，混匀后沸水浴反应5 min，流水冲洗冷却至室温，最后用适量的水稀释到一定体积，于540 nm下测吸光值[11-13]。

体外抑制胰脂肪酶活性的测定：取3 mL茶样和1 mL酶溶液于试管中，混匀后放入37℃恒温水浴锅中水浴10 min，然后加入1 mL橄榄油，再放入温水浴中震荡水浴10 min，再加2 mL苯，继续反应2 min，终止反应。取上层有机相于新的离心管中，加1 mL显色剂涡旋振荡3 min，取用上层含有脂肪酸铜的苯溶液，用相同方法制备不含胰脂肪酶的空白溶液为对照，在710 nm波长下测其吸光度[14-15]。

1.4 数据分析

所有数据均以平均值±标准误（x±SEM）表示，试验处理重复3次，使用GraphPad Prism 8.0对数据进行统计和分析，以2016年乌龙茶为对照进行t-test分析，p＜0.05表示差异显著，p＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 主要常规生化成分

从表1中可以看出，黄金桂品种1990年的乌龙茶的水浸出物、茶多酚、氨基酸、可溶性糖和黄酮类含量均较2016年的乌龙茶低，其中氨基酸、可溶性糖和黄酮类的含量差异达到极显著差异；岭头单丛品种的乌龙茶茶多酚和氨基酸含量1990年极显著低于2016年，而可溶性糖、水浸出物和黄酮类的含量1990年高于2016年，其中可溶性糖的含量达到极显著差异；大叶奇兰品种的乌龙茶的茶多酚、氨基酸、可溶性糖和黄酮类含量1990年分别较2016年低，其中氨基酸和黄酮类的含量差异达到极显著水平，水浸出物含量则较2016年高，且达到极显著差异。这些可能与茶树品种和鲜叶原料老嫩程度不一及年份不同有关。

表1 陈年乌龙茶的生化成分含量 （%）Table 1 Contents of biochemical components in aged oolong teas （%）

2.2 儿茶素

从表2结果可知，三个品种陈年乌龙茶中GC、EGC、EC、EGCG和ECG的含量均为1990年比2016年的低，除儿茶素GC外，均达到显著或极显著差异水平；而酯型儿茶素、非酯型儿茶素和儿茶素总量也均表现为1990年比2016年低，且都达到极显著差异水平。

2.3 没食子酸与咖啡碱

三个品种1990年的乌龙茶的GA含量均比2016年的高，且达到极显著性差异。而1990年的黄金桂和大叶奇兰的乌龙茶的CAF含量均比2016年的高，达到极显著性差异；而1990年的岭头单丛的CAF的含量则比2016年低（表3）。

2.4 抗氧化能力

三个品种两个年度的乌龙茶体外总抗氧化能力的结果表明，岭头单丛乌龙茶和大叶奇兰乌龙茶的总抗氧化能力均表现为2016年的乌龙茶高于1990年的乌龙茶；两个年份的黄金桂乌龙茶的总抗氧化能力差别不大（图1）。

2.5 抑制α-淀粉酶活性

从图2可看出，1990年和2016年的乌龙茶均具有体外抑制α-淀粉酶活性，并表现出剂量依赖性。从表4结果来看，2016年的乌龙茶抑制α-淀粉酶的IC50值均小于1990年的乌龙茶，可见，两个茶树品种乌龙茶的抑制α-淀粉酶的活性2016年的茶均比1990年的茶高。

2.6 抑制胰脂肪酶活性

从图3中可看出，1990年和2016年的乌龙茶均具有体外抑制胰脂肪酶活性，且具有剂量依赖性。从表5可知，2016年的乌龙茶抑制胰脂肪酶的IC50值均小于1990年的乌龙茶，可见，两个茶树品种2016年的乌龙茶抑制胰脂肪酶的活性均比1990年的高。

表2 陈年乌龙茶的儿茶素含量 （mg/g）Table 2 Contents of catechins in aged oolong teas （mg/g）

表3 陈年乌龙茶的没食子酸与咖啡碱含量 （mg/g）Table 3 Contents of gallic acid and caffeine in aged oolong teas （mg/g）

图1 陈年乌龙茶总抗氧化能力Fig.1 Comparison of total antioxidant capacity of aged oolong teas stored in different years

图2 陈年乌龙茶抑制α-淀粉酶活性Fig.2 Comparison of the inhibition of α-amylase activity by aged oolong teas stored in different years

图3 陈年乌龙茶抑制胰脂肪酶活性的比较Fig.3 Comparison of the inhibition of pancreatic lipase activity by aged oolong teas stored in different years

2.7 陈年乌龙茶的生化成分与活性的灰色关联性

2.7.1 主要生化成分与总抗氧化能力

表4 抑制α-淀粉酶活性的IC50值Table 4 IC50 value of inhibiting α-amylase activity

表5 抑制胰脂肪酶活性的IC50值Table 5 IC50 value of aged oolong teas in inhibiting pancreatic lipase

以300 μg/mL的茶汤的FRAP值为参考序列，其余生化成分含量为比较序列，计算得到各个序列的关联系数：茶多酚=0.6292；可溶性糖=0.6057；黄酮类=0.4631；氨基酸=0.3875；总儿茶素=0.3364；咖啡碱=0.3148；没食子酸=0.2689。关联度排列顺序为：茶多酚＞可溶性糖＞黄酮类＞氨基酸＞总儿茶素＞咖啡碱＞没食子酸。表明对陈年乌龙茶的总抗氧化能力影响最大的生化成分是茶多酚，其次是可溶性糖，影响最小的是没食子酸。

2.7.2 主要生化成分与抑制α-淀粉酶活性

以IC50值为参考序列，其余生化成分含量为比较序列，计算得到各个序列的关联系数：茶多酚=0.3136；可溶性糖 =0.2781；黄酮类=0.2587；咖啡碱=0.2433；没食子酸=0.2148；氨基酸=0.2000；总儿茶素=0.1535。关联度排列顺序为：茶多酚＞可溶性糖＞黄酮类＞咖啡碱＞没食子酸＞氨基酸＞总儿茶素。表明对陈年乌龙茶抑制α-淀粉酶活性影响最大的生化成分是茶多酚，其次是可溶性糖，影响最小的是总儿茶素。

2.7.3 主要生化成分与抑制胰脂肪酶活性

以IC50值为参考序列，其余生化成分含量为比较序列，计算得到各个序列的关联系数：可溶性糖=0.4715；茶多酚=0.4396；氨基酸=0.3680；黄酮类=0.3705；咖啡碱=0.3427；总儿茶素=0.3078；没食子酸=0.2240。关联度排列顺序为：可溶性糖＞茶多酚＞氨基酸＞黄酮类＞咖啡碱＞总儿茶素＞没食子酸。表明对陈年乌龙茶抑制胰脂肪酶活性影响最大的生化成分是可溶性糖，其次是茶多酚，影响最小的是没食子酸。

3 讨论与结论

本试验对三个品种茶树不同年份的乌龙茶的茶多酚、儿茶素、氨基酸、可溶性糖等生化成分含量进行测定分析，三个品种乌龙茶的茶多酚、儿茶素和氨基酸含量均表现为2016年比1990年的高，没食子酸的含量则相反。有研究表明，绿茶与铁观音的茶多酚、儿茶素和游离氨基酸含量均随贮藏年份的增加而降低，而没食子酸的含量会增加[9-10,16]，这与本研究的结果一致。还有研究表明，铁观音和单丛的水浸出物含量随贮存时间的延长呈下降趋势，可溶性糖的含量变化则有降低也有增加[16-17]，本研究结果显示三个品种不同年份的乌龙茶的水浸出物和可溶性糖的含量变化没有明显规律，还有待进一步的研究。

岭头单丛和大叶奇兰乌龙茶体外抗氧化能力表现为2016年的比1990年的高，黄金桂乌龙茶则差别不大。灰度关联分析结果表明茶多酚对陈年乌龙茶的总抗氧化能力贡献最大，这与三个品种乌龙茶的茶多酚含量水平与抗氧化能力活性间关系相符合。进一步分析还发现，茶多酚中的主要成分儿茶素对总抗氧化能力的关联度较低，这可能与茶多酚中的其它多酚类物质，如黄酮醇类、花青素、酚酸及缩酚酸等同样具有重要的抗氧化能力有关[18-22]。

三个品种的乌龙茶体外抑制α-淀粉酶和胰脂肪酶活性均表现为2016年的比1990年的高。通过灰色关联分析可知茶多酚对陈年乌龙茶的抑制α-淀粉酶活性贡献较大，其次是茶多糖；茶多糖对陈年乌龙茶的抑制胰脂肪酶活性贡献较大，其次是茶多酚。王林戈等人的研究结果表明茶多糖和茶多酚在协同作用时刺激细胞分泌胰岛素的效果最显著[23]。李星亚等人的研究结果表明茶多酚和茶多糖的协同作用不仅能降低血糖，还能降低甘油三酯和胆固醇的含量，同时能提高高密度脂蛋白的含量，促进了体内的糖脂代谢[24-25]。可见，茶多酚和可溶性糖在降血糖和降血脂方面均具有重要的作用。这与三个茶树品种的乌龙茶茶多酚和可溶性糖含量2016年比1990年高相符合。