紫景天黄酮对大鼠实验性牙周炎中iNOS的影响

姜 静，王晓峰，邱丽娜，王 伟，张殿文，宋莲莲*,桑 雪*

(1.吉林省中日联谊医院 口腔科，吉林 长春130033；2.吉林省中医药科学院，吉林 长春130021)

牙周炎患者众多，机制尚不明确，治疗方法有限。诱导性一氧化氮合酶(iNOS)在牙周炎患者的牙龈组织中的表达明显高于正常人，其表达强度与慢性牙周炎症程度密切相关[1]。本研究采用免疫组化方法检测紫景天黄酮对大鼠实验性牙周炎牙周组织中iNOS表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康Wistar大鼠28只，购买于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，体重180-220 g，年龄6-8周，许可证号：SCXK(吉)-2016-0003。

1.1.2实验药剂 iNOS一抗(北京博奥森生物科技有限公司)，DAB染色试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)，多聚HRP二抗试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司)，浓度1.0%紫景天黄酮(基质为16%泊洛沙姆)由吉林省中医药科学院制剂室提供,脂多糖(LPS，吉林省中日联谊医院科学研究中心配制)。

1.1.3实验器械 Leica RM2255型石蜡切片机(德国 Leica 公司)，Leica EG1140石蜡包埋机(德国Leica公司)，OlympusBX51光学显微镜(日本 Olympus 公司)，NIS-ELEMNT BR型图像分析系统(日本NIKON公司)。

1.2 方法

1.2.1实验性牙周炎模型的制备 28只健康Wistar大鼠，雌雄各半，随机选取8只为正常组。余下20只为建模组大鼠，根据参考文献[2,3]方法用带牙龈卟啉单胞菌丝线结扎法建立大鼠实验性牙周炎模型，并在牙周局部涂抹含1 mg/ml LPS的生理盐水，15 μl/次,每 48 h涂抹 1 次,共 4 次。四周后检查牙周情况，牙周指数为中重度牙周炎的改变，随机处死2只，作病理观察，镜下牙周组织内见大量炎细胞浸润，微小脓肿形成；牙龈深层组织内形成水肿与纤维组织增生，牙槽骨吸收，证明模型建立成功。

1.2.2药物干预 将建模成功后的大鼠随机分为模型对照组和紫景天黄酮治疗组。在治疗组和模型组大鼠牙周病患牙龈沟内分别注入紫景天黄酮凝胶和基质，0.5 ml/次/只，每日2次，次间隔为8 h，连续涂药14天。正常组不做处理。

1.2.3牙周指数检测 给药前和给药结束后分别检查治疗组和模型组大鼠的牙龈指数(GI)和龈沟出血指数(SBI)。检测方法：用3%水合氯醛10 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，将其固定在木板上，用牙周探针沿牙周炎患牙的颊侧龈缘轻轻滑动，按照国际通用标准记录三组大鼠的GI和SBI。正常大鼠牙龈指数为0。

1.2.4病理组织取材 治疗结束后，三组大鼠全部处死，取患牙牙周组织甲醛固定，梯度脱水、石蜡包埋切片。

1.2.5免疫组化染色 石蜡包埋切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水，室温下用0.3%过氧化氢处理30 min。微波修复抗原5 min后，用非免疫性血清封闭，滴加iNOS抗体，4℃，过夜；然后二抗反应，室温孵育2 h。以DAB为底物显色后，苏木精复染，常规树脂封片。

1.2.6镜下观察 iNOS阳性信号表现为棕黄色或浅黄色，主要在牙周鳞状上皮，疏松结缔组织内的血管内细胞，成纤维细胞胞浆内表达阳性信号。采用NIS-ELEMNT BR型图像分析系统，分析iNOS表达的平均光密度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 牙龈指数和龈沟出血指数(见表1)

治疗前模型组和治疗组的GI和SBI均无显著差异(P>0.05)，治疗后紫景天黄酮治疗组大鼠牙周指数均明显低于模型组(P<0.001),且明显低于给药前(P<0.001)，模型组给药前后牙周指数比较略有增高，但无明显差异(P>0.05)。

表1 模型组和紫景天黄酮治疗组牙龈指数和龈沟出血指数

注：与给药前比较，#P<0.001,与模型组比较※P<0.001。

2.2 iNOS在三组中的表达

正常组内牙龈上皮结构完整，iNOS表达较少(图1)，模型组内牙龈上皮可见溃疡与糜烂，炎性纤维成分中iNOS阳性信号高表达(图2)，治疗组牙龈组织内炎细胞数量减少，iNOS表达减少(图3)。 iNOS在三组中表达量的比较见图4，治疗组iNOS的表达量明显低于模型对照组(P<0.01),模型对照组iNOS表达量明显高于正常组(P<0.01)。

图1 正常组(×200) 图2 模型对照组(×200) 图3 治疗组(×200)

图4 紫景天黄酮对实验性牙周炎大鼠血清中iNOS的影响

3 讨论

一氧化氮合酶(NOS)是机体合成一氧化氮(NO)最主要的限速酶[4],对NO在组织细胞中的含量有重要的调节作用，影响骨组织的修复，可间接反应机体的免疫及炎症状态[5]。有研究表明iNOS与炎症的病理变化具有一定的相关性，有炎症因子等刺激时大量表达，其高表达与牙周及牙髓炎症具有相关性[6,7]。本研究大鼠实验性牙周炎牙周组织免疫组化检测结果表明，实验性牙周炎大鼠牙周组织中iNOS的表达明显高于正常大鼠的牙周组织，提示牙周炎局部的损伤、炎症因子、细菌内毒素等可能与iNOS的表达有一定的相关性。

紫景天为长白山野生药材，其主要化学成分为多种黄酮类化合物。紫景天黄酮具有止血、减少毛细血管通透性、消肿止痛、促进溃疡愈合、抑制牙周炎易感菌、增加大鼠自由基清除酶活性和降低自由基等功效[8，9]。

本研究紫景天黄酮提取物治疗大鼠实验性牙周炎，治疗组治疗后牙周指数明显降低(P<0.001)，与模型组比较有显著差异(P<0.001)，表明紫景天黄酮具有明显减轻大鼠实验性牙周炎症的作用。

iNOS表达可能与牙周炎症程度有一定的相关性[7]，本研究大鼠牙周组织切片免疫组化检测显示治疗组牙周组织中iNOS的表达明显低于模型组，紫景天黄酮可能通过抑制iNOS的生成或降低其活性，从而产生了抗炎作用。

本研究采用紫景天黄酮凝胶剂为纯中药制剂，使用方便，可以避免抗生素类药物产生的弊端。牙周炎患者群众多，是导致牙齿丧失的主要原因之一。紫景天药源丰富，将其开发研制成治疗牙周炎的中药制剂，对牙周炎的防治具有重要的社会效益和经济效益。紫景天治疗牙周炎的更多机理有待于进一步研究。