炎症性肠病患者结肠组织和血清中白细胞介素34的表达

王许平， 王素敏， 孙亚星， 耿 丽， 王丹丹， 杨贝贝， 杜晓博， 高 闯， 冯百岁

郑州大学第二附属医院消化内科，河南 郑州 450014

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)，是一组病因不明的胃肠道慢性反复发作性疾病，目前普遍认为其与遗传、环境、微生物及宿主的免疫因素相关，主要特征是机体免疫功能紊乱所致的不恰当的免疫反应，从而造成组织损伤，而细胞和细胞因子之间的相互作用驱动了炎性途径和组织损伤[1-3]。白细胞介素34(interleukin-34,IL-34)是近年来发现的一种新型的细胞因子，可结合单核细胞及巨噬细胞表面的集落刺激因子受体(CSF-1R),促进巨噬细胞的增殖、分化，也有研究[4]表明，它能够促进多种促炎细胞因子及趋化因子的分泌，如IL-6、IL-8、CCL20等，引起一系列炎症反应。本研究检测了IBD患者结肠组织与血清中IL-34的表达，并分析其与临床指标及疾病严重程度的关系，旨在探讨其在疾病中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料选择郑州大学第二附属医院2017年1月至2018年7月门诊和住院的活动期IBD患者69例，所有患者均符合2018年中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组制定的UC与CD诊断标准，评估UC的活动性采用改良的Mayo评分系统，评估CD的活动度采用Best克罗恩病活动指数计算法[5]。共纳入UC患者48例，男26例，女22例，年龄(44.9±15.3)岁(17～82岁)，其中，缓解期患者9例，轻度患者11例，中-重度患者28例；CD患者21例，男12例，女9例，年龄(41.9±17.3)岁(15～72岁)，其中，缓解期患者6例，轻度患者6例，中-重度患者9例。24例结肠组织对照组为结肠癌行外科手术切除的癌旁组织(癌旁对照组)，均经病理证实，男14例，女10例，年龄(37.6±10.2)岁(25～54岁)。29名健康志愿者为血清对照组(正常对照组),男13名，女16名，年龄(42.5±10.7)岁(25～70岁)。所有对象排除合并其他自身免疫性疾病、恶性肿瘤及其他急慢性感染性疾病。研究对象均签署知情同意书。

1.2IBD患者临床资料的收集记录IBD患者血清ESR及CRP数据。

1.3结肠组织中IL-34的表达采用免疫组织化学法测定。取石蜡切片置于60 ℃烘箱中烘烤60 min；二甲苯脱蜡；梯度乙醇水化；抗原修复；灭火内源性过氧化物酶；加山羊血清封闭液；滴加兔抗人IL-34多克隆抗体(博奥森生物技术有限公司)(稀释度为1∶600)；加生物素标记二抗，酶标链亲和复合物；DAB显色；苏木素复染；盐酸乙醇分化；各步骤之间用PBS冲洗3次，每次5 min，最后脱水封片。严格按照说明书进行各步骤操作。免疫组织化学结果判断：阳性细胞表现为细胞质或细胞核中出现棕黄色的颗粒，根据染色的广度和强度进行评分。在光学显微镜400倍下阅片，选择无边缘效应、无组织折叠等影响读片效果的典型部位，随机选取5个不重复视野，取每个视野内的平均阳性细胞数作为计数标准，每个切片分别由两名病理科医师计数，在双盲下行结果评分判断，计数100个细胞，阳性所占百分比：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕色或棕黄色为2分，棕褐色或褐色为3分。以上两项得分之和<3分为阴性，≥3分为阳性。

1.4血清IL-34水平检测所有研究对象清晨空腹,采集外周静脉血3 ml,抽血后速离心,离心率3 000 r/min,离心15 min收集血清,于-80 ℃保存待测,实验前于室温变融后使用,血清中IL-34的检测采用武汉优尔生科技股份有限公司生产的双抗体夹心ELISA法检测试剂盒,严格按照说明书操作。

1.5观察指标记录研究对象结肠组织和血清中IL-34的表达，外周血ESR及CRP表达。

2 结果

2.1IBD患者与正常对照组血清IL-34表达水平的比较UC活动期和CD活动期血清IL-34的表达均高于正常对照组，而UC缓解期和CD缓解期与正常对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。中-重度UC和CD患者血清IL-34分别高于轻度UC和CD患者。

表1 各组血清IL-34的表达Tab 1 Serum expression of IL-34 in each group

注：F=38.762，P<0.05；与正常对照组相比，aP>0.05；与缓解期相比，bP<0.05; 与轻度相比，cP<0.05。

2.2血清IL-34与疾病活动度之间的关系在UC活动期患者中，血清IL-34的表达水平与疾病活动度呈正相关(r=0.666,P=0.000)，在CD活动期中，血清IL-34的表达水平与疾病活动度呈正相关(r=0.768，P=0.000)。

2.3血清IL-34与疾病活动指标的关系在CD活动期患者中，血清IL-34与CRP(r=0.732，P=0.002)及ESR(r=0.564，P=0.028)均呈正相关。同时，在UC活动期患者中IL-34与CRP(r=0.673，P=0.000)及ESR(r=0.550，P=0.000)也呈正相关(见图1)。

图1 患者血清IL-34与CRP及ESR相关性分析 A～B：CD活动期组;C～D：UC活动期组 Fig 1 The correlation analysis of serum of patients between IL-34 and CRP and ESR A-B: active CD group;

2.4各组结肠组织中IL-34的表达癌旁组织对照组、CD缓解期组、UC缓解期组、CD活动期组和UC活动期组结肠组织中IL-34表达的阳性率分别为16.7%(4/24)、33.3%(2/6)、22.2%(2/9)、73.3%(11/15)、66.7%(26/39)，差异有统计学意义(χ2=8.911，P=0.030)，UC活动期和CD活动期分别与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；UC缓解期和CD缓解期与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；UC活动期和UC缓解期相比，差异有统计学意义(P<0.05)；CD活动期和CD缓解期相比，差异无统计学意义(P=0.088)；UC活动期和CD活动期相比，UC缓解期和CD缓解期相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见图2)。

图2各组结肠组织中IL-34的表达(400×)

A：癌旁组织对照组;B：CD活动期组;C：UC活动期组;D：CD缓解期组;E：UC缓解期组

Fig2ExpressionofIL-34ineachcolontissuegroup(400×)

A:control group; B: active CD group;C: active UC group; D: paracmastic CD group; E: paracmastic UC group

3 讨论

IBD是胃肠道慢性反复发作性疾病，病因尚不清楚，目前普遍认为与遗传、宿主免疫及环境因素有关。其中，肠黏膜免疫异常是重要的病因之一，在免疫应答过程中促炎因子与抑制性细胞因子的表达失衡在IBD的发病机制中具有重要作用[6-7]。IL-34是一种新型的细胞因子，与多种免疫及炎症性疾病相关，而IL-34在IBD的研究中仍较少。

本研究结果显示，UC活动期组、CD活动期组、UC缓解期组、CD缓解期组、正常对照组血清中IL-34的浓度分别为(61.26±17.17)pg/ml、(67.64±16.72)pg/ml、(29.12±7.15)pg/ml、(30.46±6.31)pg/ml、(26.43±7.14)pg/ml。在活动期IBD患者中血清IL-34的水平明显高于缓解期及对照组，且中-重度患者血清IL-34水平高于轻度，与疾病活动度呈正相关。同时，在活动期UC和CD患者中血清IL-34与临床疾病活动指标CRP及ESR呈正相关。进一步在结肠组织中，我们发现活动期UC及活动期CD患者IL-34的表达高于癌旁组织对照组，其中活动期UC高于缓解期UC，但在CD患者中，活动期虽然高于缓解期，差异无统计学意义，考虑可能与样本量小有关。IL-34在组织中的作用及其作用机制仍需进一步深入研究。

IL-34由单核巨噬细胞系统、内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、肝细胞和上皮细胞等分泌，并且持续高表达于心脏、脑、肝脏、小肠和结肠等器官组织中。它是CSF-1R的第二配体，能够与M-CSF共同激活CSF-1R，它与前者具有相似的功能，但具有不同的特征和信号模式，对CSF-1R的激活作用更强。而在IBD中炎症部位常伴有大量单核/巨噬细胞的浸润，这些细胞对炎症刺激产生反应，进一步刺激增强细胞因子及趋化因子的产生[4,8-9]。研究表明，在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等多种炎症相关的疾病中，IL-34与一些炎症指标及疾病活动度均表现出一定的相关性[4]。近年来，越来越多的研究表明，IL-34与炎症途径密切相关，参与并促进了炎症性疾病的发生、发展。TRUONG 等[10]发现，在鸡的细胞系中，IL-34可与CSF-1R结合，从而激活JAK2/STAT、NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶信号传导途径，进而调节细胞因子的表达，可检测到TNF、Th1(IFN、IL-1β)型和Th17型(IL-12p40、IL-17A、IL-17D)细胞因子的表达明显增加。在类风湿关节炎中，与对照组相比，患者血清IL-34、IL-6、IL-8、TNF-α的水平明显增高，且IL-34与IL-6、IL-8、TNF-α及疾病活动度呈正相关。而在接受治疗期间，IL-34水平显著下降，同时伴ESR、CRP等炎性指标的下降[11]。ZWICKER 等[12]发现，IBD患者结肠炎症部位中IL-34 mRNA表达明显高于非炎症部位，进一步在Caco2细胞中进行的研究发现，TNF-α可通过增加NF-κB而使IL-34的表达增强。在DSS诱导的实验性结肠炎小鼠模型中同样检测到IL-34 mRNA表达较正常对照组明显上调。我们的研究同样发现，在UC和CD患者中IL-34的表达均明显高于对照组，两者之间差异无统计学意义，IL-34在结肠上皮及固有层中均有较明显的表达，结合前人的研究，IL-34在炎症途径中具有重要作用，而IBD的发生、发展中免疫功能的紊乱及过激的炎症反应为其重要的特征，IL-34或许可以作为未来IBD治疗的靶标。同时，活动期UC与CD患者血清中IL-34水平的明显增加，并与疾病严重程度和疾病活动指标呈正相关，预示它或许可以作为该疾病活动度的标志物。

综上，IL-34在IBD患者血清及肠组织中表达增加，提示可能参与了IBD的发生、发展，有望成为新的治疗靶点和生物标志物。