lncRNA与肝癌相关性研究进展

靳秀丽，李异玲

中国医科大学附属第一医院消化内科，辽宁 沈阳 110001

人类基因组中超过90%为转录组[1-3]，然而转录组中约有2万个蛋白质编码基因，少于整个基因组序列的2%[4]。随着二代测序技术的快速发展，成千上万的长链非编码RNA(long nonprotein coding RNA，lncRNA)在脊椎动物和非脊椎动物体内被快速鉴别出来。lncRNA绝大多数位于细胞核内，他们的生理学及病理学功能逐渐被关注。lncRNA功能广泛，参与基因表达的各个方面到蛋白质的翻译及稳定，参与细胞分化，器官形成。同时参与病理学改变，与多种疾病密切相关，如恶性肿瘤、心血管疾病、内分泌疾病等。虽然一些lncRNA由RNA聚合酶Ⅲ产生，但大多数lncRNAs被证实像编码基因一样，也是由RNA聚合酶Ⅱ转录[5-6]，RNA聚合酶Ⅱ位于细胞核内[7]，因此lncRNA主要在细胞核内产生。lncRNA也经历转录后编辑过程，包括5′加帽、选择性拼接、RNA编辑、聚腺苷酸化，然而，不像编码RNA，lncRNA不具有开放的阅读框，不编码蛋白质。根据lncRNA在染色体上与蛋白编码基因的相对位置分类，人类基因组中约有一半的lncRNA为基因间长链非编码RNA(long intergenic nonprotein coding RNA，lincRNA)[8]。lncRNA在丰度、基因组定位、亚细胞定位及代谢特征、表观遗传调控、组织特异性等方面与mRNA不同[9]。lncRNA主要分布在细胞核、染色质或亚核区域，在细胞质中分布较少[10]。与mRNA相比，lncRNA合成效率低、降解效率高、剪接速度慢[9]。lncRNA比mRNA更大程度地限定在特定的细胞类型上，有进化保守功能，有二级机构，微同源区域，但有较小的整体序列相似性[11-13]。现在，lncRNA广为人知，在不断的研究和探索中，我们意识到非编码基因组的重要作用。lncRNA通过与其他大分子相互作用，驱动许多重要的癌症表型，这些大分子包括DNA、RNA及蛋白质[14]。

1 lncRNA的调控功能

1.1lncRNA调节染色质重塑lncRNA被发现能控制染色质重塑复合物，改变核小体间隔[15]。在人类前列腺癌中，基因表达分析显示,SWI/SNF 和 lncRNA SChLAP1角色对立，SChLAP1与染色质重塑复合物SWI/SNF的亚基SNF5相互作用，阻止SWI/SNF与染色质捆绑，结果导致全基因组基因活性不被抑制[15]。lncRNA还能与染色质修饰剂非特异性结合,与转录因子相互作用，调节基因表达，如lncRNA RMST通过调节转录因子SOX2与它约一半的结合位点的结合促进神经元的分化[16]。

1.2lncRNA调节DNA甲基化许多lncRNA与多梳复合物结合，促进PRC占领基因甲基化位点，阻止DNA甲基化[16]。在HOXC簇内转录的HOTAIR RNA与Polycomb抑制因子复合物2相互作用，导致HOXD位点的几个基因的甲基化和沉默[17]。

1.3转录干扰许多lincRNA的转录与蛋白质编码基因的转录形式非常接近[18]，这些非编码RNA更有可能产生转录干扰作用，在一项研究中，约有一半的lincRNA被转录在蛋白质编码基因附近(<10 kb)[19]，所以这些非编码RNA可能是研究邻近基因转录调控的最佳物质。

1.4转录后水平的调节一些lncRNA通过与剪切因子相互作用影响剪切方式，例如lncRNA pnky与剪切因子PTBP1结合，调节相关基因的剪切方式，涉及神经形成[20]。lncRNA MALAT1是正确拼接的必要条件，它可以在核中分离剪接因子，进一步调节剪接效率[21]。

1.5lncRNA调节RNA代谢这是一个新兴的主题，lncRNA在mRNA的稳定性控制、剪接和翻译等方面起重要作用，lncRNA STAU1通过在选择的mRNAs 3′UTR中与双链RNA相互作用，介导mRNA的衰变。最近有报道确认了lncRNA在维持基因组稳定性方面的作用，lncRNA NORAD被证明对染色体稳定性有深远影响，NORAD从目标mRNA中分离出PUMILIO蛋白，PUMILIO蛋白通过降低mRNA的稳定性和翻译能力，对mRNA进行负调控[14]。lncRNA还能被加工裂解产生小RNA，如miRNA、piRNA等。一些lncRNA还能与小RNA通过碱基配对来调节小RNA的活动,如lncRNA可以与miRNA对应的靶基因mRNA相互作用, 竞争性地抑制miRNA活性,影响基因表达[22]。

1.6组蛋白修饰组蛋白修饰复合物与lncRNA相互作用的1个重要例子是异染色质修饰蛋白PRC2，来自于哺乳动物X染色体失活(XI)的研究。X染色体失活特异转录本(Xist)是X染色体失活中心内鉴定出的第1个关键的XI调控基因，Xist与lncRNA RepA协同包裹X染色体并募集PRC2，建立H3K27me3引起X染色体失活[23-25]。

1.7作为蛋白质和RNA的诱饵lincRNA可通过分离作用抑制蛋白质、mRNA和miRNA的活性,如lincRNA Gas5通过形成一种双链结构，结合糖皮质激素受体的DNA结合域，模拟糖皮质激素反应素，这种相互作用阻止糖皮质激素受体结合其靶基因，阻止转录激活[9]。

1.8编码微肽有研究报道一些lncRNA的位点可以发生改变，产生更小的RNA或重新获得编码能力，产生微肽。广州医科大学附属第三医院晏光荣组发现一个名为lncRNA HOXB-AS3的基因，编码产生一个53个氨基酸的保守多肽，并证实了该多肽能够抑制结肠癌细胞的生长、克隆形成和侵袭转移，丰富了对lncRNA作用方式和功能机制的认识[26]。

2 lncRNA在肝癌发生、发展中的调控作用

肝癌作为最常见的恶性肿瘤之一，有着较高发病率及死亡率，严重威胁人类的健康，给社会及医疗带来沉重的负担。目前对于肝癌的早期诊断方法仍极为有限，肝癌的治疗及预后不甚理想。随着二代测序技术的发展，人们逐渐发现体内含有的非编码RNA发挥重要的功能。lncRNA已经被证实与肝癌细胞的增殖、侵袭及预后密切相关，可作为致癌基因诱发肝癌发生，加速肝癌细胞生长和转移。lncRNA有望成为肝癌新的生物标志物和治疗靶点，针对lncRNA的研究将为肝癌或肝病患者带来新希望。

2.1lncRNA-ATB促进肝癌的转移细胞转化生长因子β被发现在肝细胞癌细胞中诱导lncRNA-ATB过表达，在上皮细胞间质转化过程中，lncRNA-ATB竞争性地结合miR-200激活了ZEB1和ZEB2的表达，ZEB1和ZEB2与白细胞介素-11 mRNA的相互作用增强了Stat3信号，促进肝细胞癌转移，加速器官受累等[14,27]。

2.2lncRNAHULC影响肝癌的增殖侵袭和预后与正常肝组织相比，lncRNA HULC在肝癌中表现出高表达水平，在埃德蒙森等级分类中，高级别的癌症中HULC的表达水平更高，并与疾病侵袭相关[28]。在肝癌中明显上调的lncRNA HULC存在于肝细胞癌患者的血液中[29]。研究还发现HULC吸引几个miRNA，如miR-372，导致靶基因即转录因子CREB的转录抑制，在HULC启动子内的CREB通过一个自动调节机制抑制miR-372的功能，支持在肝癌内CREB介导的HULC表达上调，此外，HULC与乙肝病毒X蛋白的上调有关，乙肝病毒X蛋白是肝细胞癌发生的重要病因，也可增强HULC的表达[30]。研究还发现，HULC介导的肿瘤抑制因子P18的下调可促进肝细胞癌的细胞增殖[31]。lncRNA HULC在肝转移癌中过表达提示生存率低。上述研究支持HULC具有作为肝癌生物标志物的潜能。

2.3肝癌中表达异常的lncRNAHOTTIP和lncRNAHOXABlncRNA HOTTIP和lncRNA HOXAB的表达上调与肝细胞癌的发展和预后相关[32]。具体作用机制尚不清楚。

2.4lncRNAHOTAIR促进肝癌的发生LI等[33]研究证实，lncRNA HOTAIR通过对SETD2的下调来促进人类肝癌干细胞的恶性生长。他们在18例人类肝癌组织中检测到HOTAIR，与对应的相同患者相邻非癌组织进行配对，进行RT-PCR，结果显示人肝癌组织中HOTAIR水平显著高于配对的相邻非癌组织。免疫组化实验显示，在肝细胞癌组织中SETD2的表达与相邻癌旁组织相比减少。综上，在人类原发性肝癌中，HOTAIR上调表达与SETD2下调表达呈负相关。他们的进一步研究发现，HOTAIR降低了CREB、P300、RNApoⅢ在SETD2启动子区域的重新分配，从而抑制了SETD2的表达和磷酸化，使SETD2对基质组蛋白H3的结合能力下降，触发组蛋白H3的第36个赖氨酸的三甲基化降低，因此，H3K36me3-hMSH2-hMSH6-skp2复合物也随之减少，这种复合物在染色质上的含量随之降低，可阻止错配的DNA修复，降低了skp2的降解能力(skp2可降解老化的组蛋白，代之以新的组蛋白，对DNA修复极为重要)，老化的组蛋白H3与受损的DNA结合，损伤的DNA未被修复，引起微卫星不稳定和细胞周期相关基因的异常表达，可触发肝细胞癌的发生[33]。

2.5lncRNACUDR促进肝癌干细胞增殖，影响肝癌预后PU等[34]研究发现,lncRNA CUDR协同CyclinD1，或协同PTEN的减少，可加速肝癌干细胞生长和肝脏干细胞在体内、体外的恶性转化，CUDR高表达的患者比低表达的患者预后更差。在大多数哺乳动物中，PTEN已被鉴定为人类肝癌中常见的肿瘤抑制因子之一，在肿瘤发展过程中，PTEN的突变和缺失会导致酶活性丧失，从而导致细胞增殖增加，死亡减少[35]。实验中发现和癌非干细胞相比，CUDR转录水平在癌干细胞中显著升高。实验发现，细胞中PTEN的减少可导致CUDR对CyclinD1的结合能力增强，绝缘体CTCF招募CUDR-CyclinD1复合物形成CUDR-Cyclin D1-绝缘体CTCF复合物，此复合物定位于c-myc基因启动子区域，增加了癌基因c-myc的产生，c-myc可导致肝癌干细胞和肝细胞样干细胞的恶性增殖[34]。

2.6lncRNA广泛参与干细胞的维护和分化例如，lncTCF7是肝癌干细胞自我更新和肿瘤增殖所必需的。从机制上讲，在TCF7启动子区域由lncRNA TCF7招募来SWI/SNF复合物，以激活Wnt信号，维护肝癌干细胞的自我更新[36]。也体现了lncRNA在肿瘤生长和繁殖中的作用。

2.7lncRNANEAT1影响肝癌的发生和预后lncRNA NEAT1促进肝癌的发生，且lncRNA NEAT1的高表达提示肝癌的预后差，现在已有几个研究小组证实了lncRNA NEAT1是P53的靶基因，通过促进表达致癌基因的细胞存活，使肿瘤在体内发生，如激活鼠模型体内的Kras，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变[37-39]。

2.8lncRNAMT1DP为肝癌的抑制剂MT1DP的过表达减少细胞增殖和集落形成，增加肝癌细胞的凋亡，而敲低该lncRNA出现相反的作用，表明MT1DP起到肿瘤抑制剂的作用。研究还发现，Runt相关转录因子2(Runx2)和Yes相关蛋白(YAP)能够通过直接启动子结合抑制lncRNA MT1DP的表达，FoxA1蛋白对YAP和Runx2表达起着积极的作用。从而证实，Rnux2和YAP通过依赖FoxA1而相互作用，抑制肿瘤抑制因子lncRNA MT1DP的表达，在肝癌细胞中起着促癌作用[40]。

2.9lncCAMTA1影响肝癌的发生和预后DING等[41]使用lncRNA微阵列分析，发现了一种新型lncRNA，称之为lncCAMTA1，发现它在肝癌干细胞和肝细胞癌中均增加。体外和体内功能实验显示，lncCAMTA1的过表达促进肝细胞癌细胞增殖、癌干细胞样性质和肿瘤发生，敲低lncCAMTA1的表达会抑制肝细胞癌细胞增殖、癌干细胞样性质和肿瘤发生，肝细胞癌中lncCAMTA1高表达表明预后不良。从机制上，他们证明lncCAMTA1与钙调蛋白结合转录激活子1(CAMTA1)启动子相关，诱导抑制染色质结构并抑制CAMTA1转录，lncCAMTA1和CAMTA1的表达在肝细胞癌组织中呈负相关。此研究提示，lncCAMTA1有望成为有效的诊断及预后标志物和治疗的靶点。

2.10lnc-DILC的抑癌作用WANG等[42]通过微阵列鉴定和实时PCR验证等在体外和体内对lnc-DILC在肝癌干细胞中的作用进行了评估。研究发现，lnc-DILC的减少显著增强了肝癌干细胞的扩展并促进肝细胞癌的发生和进展。数据表明，lnc-DILC介导了TNF-α/NF-κB信号传导和IL-6/STAT3之间的交叉干扰。临床研究也证实了肝细胞癌患者lnc-DILC的减少。 可见，肝细胞癌患者中lnc-DILC的表达降低可能预示患者的早期复发和短期存活，突出其诊断、治疗及预后评估价值。

目前，大多数药物都表现出抑制的作用机制，然而在许多遗传疾病中，在特定条件下，需要基因上调，如肿瘤抑制因子、生长因子、转录因子。lncRNA可以上调或下调基因表达和改变染色质结构。例如，神经退行性疾病，至少在早期治疗时可通过增强神经保护生长因子活性来减缓病情[43]。其他临床前研究也证实了以lncRNA为靶点的疗效，例如，在小鼠MMTV-PYMT乳腺癌模型中，lncRNA Malat1可以促进肿瘤生长和转移，在此模型中，ASOs以Malat1为靶点，通过促进囊性分化，增加细胞黏附，减少迁移，证明了其在体内的治疗效果[44]。成千上万的lncRNA从基因组中被识别出来，它们在正常组织和来自同一器官的肿瘤组织之间的转录差异性，揭示了lncRNA可以作为肿瘤生物标志物的巨大潜能[45-46]。

事实证明,lncRNA不是转录的废物，而是正常发育所必需。目前只有极少部分的lncRNA的生物学功能得到阐述，对这些分子的作用方式仍然知之甚少。目前绝大多数针对lncRNA的研究基于体外分化系统进行，许多发现仍缺乏体内研究证据。分析lncRNA功能及作用模式比编码RNA更复杂、更艰难。lncRNA通常具有高度的组织特异性，尽管其靶向基因调控机制尚不清楚，但不可否认lncRNA具有潜在的诊断和治疗价值。所以需要系统的方法来定位和描述lncRNA，必须建立各种遗传模型系统以了解lncRNA的功能作用，需要大量工作来充分评估其作为治疗靶位的潜力。lncRNA已经被证实与肝癌的发生、发展及预后密切相关，可作为致癌基因诱发肿瘤发生。相信不久的将来，lncRNA能为肝癌乃至肝病的诊治带来巨大的突破。