Aiolos基因多态性与贵州汉族人群系统性红斑狼疮的相关性*

杨莹， 杨英， 陈晓红△， 陈林， 梁翰月， 罗丽， 贾常莎， 陈永艳， 晏文

1遵义医学院附属医院皮肤科 (贵州遵义 563000)； 2遵义医学院第二附属医院皮肤科(贵州遵义 563000)； 3遵义市第一人民医院皮肤科(贵州遵义 563002)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多基因的疾病，多种基因表达的异常导致B淋巴细胞和(或)调节细胞如T细胞、树突状细胞功能失调，促使B细胞产生病理性自身抗体[1-4]。SLE遗传发病机制中其发病率和患病率在不同地区、种族有很大差异。Aiolos基因(IKZF3)基因位于染色体17q21区域，其编码的Aiolos蛋白是锌指蛋白家族的成员，对T、B淋巴细胞以及自然杀伤细胞的发育具有重要作用。近年来，Aiolos基因被发现是多种免疫相关疾病的候选基因[5-7]。目前一些研究提示Aiolos基因多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)可能与SLE有关[8]。为研究贵州汉族人群Aiolos基因多态性与SLE相关性，我们选择Aiolos基因rs9909593、rs9635726及rs12150079 3个SNP位点，利用SNaPshot法对其进行基因分型，探讨其与SLE发病风险的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取SLE患者213例(SLE组)，来自遵义医学院附属医院2014年10月至2017年10月就诊的门诊和住院患者，其中男16例，女197例,年龄8～68岁，平均(32.93±12.15)岁。所有纳入研究对象均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类和诊断标准[9]。187例健康对照组为同一时期在我院体检的正常健康人群，其中男16例，女171例，年龄12～69岁，平均(33.48±10.61)岁。两组年龄、性别构成差异均无统计学意义(P>0.05)，且其一、二、三级亲属中均无SLE患者。所有纳入对象均为贵州汉族人，无亲缘关系，无近期有感染及其他免疫性疾病。本研究获本院伦理委员会批准，所有的研究对象均签署知情同意书。

1.2 SNP位点选择 根据HapMap dbSNP数据库(www．hapmap．ncbi．nlm．nih．Gov)及查阅相关文献，我们选择标签SNP(rs9909593、rs9635726、rs12150079)纳入本研究，3个SNP位点均满足：(1)选择SLE有相关性的单核苷酸多态性；(2)位点在中国人群的最小等位基因频率(MAF)均>0．05。

1.3 实验步骤

1.3.1 标本采集及基因组DNA提取 采集SLE患者及健康对照者外周静脉血2 mL置于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)真空抗凝管中，根据Magen DNA提取试剂盒说明书提取白细胞基因组DNA，并标记置于-80℃低温冰箱保存备用。

1.3.2 SNaPshot基因分型

1.3.2.1 PCR扩增引物及SNaPshot引物设计及合成 参照GenBank中Aiolos基因的引物序列查找Aiolos基因rs9909593、rs9635726、rs12150079 3个位点的引物序列，运用primer5.0设计引物，由北京六合华大基因科技有限公司合成提供，见表1～2。

1.3.2.2 多重PCR PCR反应体积为30 μL，包括10×DNA聚合酶缓冲液3 μL，dNTP 2 μL，基因组DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，引物混合1 μL，H2O 20.8 μL。多重PCR扩增条件为96℃预变性2 min，96℃变性20 s，54℃退火10 s，72℃延伸30 s，反应35个循环，再次72℃延伸2 min，4℃保存。

1.3.2.3 PCR产物纯化 采用美国ABI公司生产的SAP和Exo Ⅰ进行。反应体系为8 μL，其中PCR产物为6 μL，酶混合液2 μL(含2U SAP和2U Exo Ⅰ)；反应条件：37℃孵育保温1 h，然后75℃保温15 min以灭活SAP和Exo Ⅰ酶，纯化好后进行单碱基延伸反应，预先混好延伸引物。

表1 PCR 扩增引物

F:正向扩增引物；R:反向扩增引物

表2 SNaPshot单碱基延伸引物

1.3.2.4 SNaPshot反应 采用美国ABI公司生产的ABI PRISM SNaPshot Muhiplex Kit进行。反应体系为5 μL，其中PCR产物为3 μL，SNaPshot Mix 0.5 μL，延伸引物混合1 μL；反应条件为95℃预变性2 min，95℃变性10 s，50℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，反应35个循环，12℃保存。

1.3.2.5 SNaPshot反应产物纯化 SNaPshot延伸产物用SAP纯化。在5 μL上述SNaPshot PCR产物中加入0.5 U SAP，震荡混匀，37℃保温1 h，75℃保温15 min以灭活SAP，4℃可保存24 h 或-20℃长期保存。

1.3.2.6 采用ABI 3730XL测序仪测序分型产物 取1 μL SNaPshot延伸产物，加入Hi-Di Formamide 6.5 μL、GS-120LIZ 0.5 μL，上机经ABI 3730XL检测，使用GENEMarker软件分析峰图结果。为保证分型的准确度，随机挑选8例样本进行双向测序，均未发现分型错误。3个位点的分型成功率为98%。测序与基因分型由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.3.2.7 连锁不平衡和单体型分析 利用SHEsis 软件对Aiolos基因rs9909593、rs9635726、rs12150079 3个位点SNP进行连锁不平衡和单体型分析。

1.4 统计学方法 所有的SNP分型数据质控、等位基因和基因型分布频率比较采用SPSS 17.0统计软件。SLE组和健康对照组分别进行Hard-Weinberg遗传平衡检验。各等位基因和基因型个数采用直接计数法计算，多态性位点各等位基因和基因型分布频率比较用2检验，并计算等位基因相对危险度的比值比(OR值)及其95%可信区间(95%CI)，采用非条件logistic回归模型分析等位基因的在多个遗传模型(加性、隐性、显性)下基因与疾病易感性，以P<0.05为差异有统计学意义。连锁不平衡和单体型分析采用SHEsis在线软件进行处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本及SNP质控 SNaPshot延伸反应：产物经ABI 3730XL扫描，结果显示400个样本均获得良好的分型结果。Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079这3个位点在SLE组和健康对照组中的基因型频率进行Hard-Weinberg遗传平衡检验，结果显示所有位点均符合Hard-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，说明样本具有群体代表性，见表3。

2.2 SNaPshot PCR扩增产物测序结果 Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079位点基因型扩增产物测序图分别见图1～3。通过峰的颜色判断碱基类型，通过峰的数量判断杂合还是纯合。其中蓝色、绿色、红色、黑色峰分别代表G、A、T和C碱基，单峰表现为纯合子，双峰表现为杂合子。

2.3 Aiolos 3个SNP位点基因型频率、等位基因频率分布及遗传模式分析 检测的Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079 SNP位点中基因型频率和等位基因频率的分布在SLE组与健康对照组间，差异均无统计学意义(P>0.05)；对上述3个SNP采用非条件logistic回归模型分析等位基因的在多个遗传模式(加性、隐性、显性)下进行不同遗传模型分析结果显示，在SLE组与健康对照组间，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.4 连锁不平衡检验和单体型分析 对rs9909593、rs9635726、rs12150079这3个SNP 进行两两间连锁不平衡检验，rs9909593与rs12150079、rs9635726与rs12150079存在完全连锁不平衡，rs9635726与rs9909593存在强连锁不平衡，见表5、图4～5。本研究采用SHEsis在线软件进行单体型种类和单体型频率的估计，以最低频率的阈值，即单体型频率<0.03的不纳入分析范围的标准，Aiolos基因rs12150079、rs9635726、rs9909593共3个位点可构建5种单体型(ACG、GCA、GCG、GTA、GTG)，在SLE组与健康对照组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)，同时非条件logistic回归分析显示，各单体型与SLE发病均无关，见表5。

表3 Aiolos基因3个SNP位点基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验 例(%)

图1 rs9909593 测序结果

图2 rs9635726测序结果

图3 rs12150079 测序结果

表5 Aiolos基因3个SNP位点连锁不平衡分析(r2/D′)

D′:连锁不平衡系数；r2：相关系数

3 讨论

Aiolos基因(IKZF3)作为IKaros家族的成员，位于17q21区域处于很强的连锁不平衡状态，参与淋巴细胞发育、分化、功能维持及凋亡的调控，是淋巴细胞发育必要的细胞因子[10]。一些研究表明，17q21

图4 SLE组连锁不平衡D′值

区域基因多态性与强直性脊柱炎、SLE、哮喘、类风湿性关节炎等的发生显著相关，因此该区域很可能是多种自身免疫病的易感区域[11]。近年来通过全基因组关联分析，IKZF1基因的rs2366293、rs1456896及Aiolos基因的rs9913957、rs8076347、rs8079075、rs907091、rs12150079[12-15]等位点在不同人群中发现与SLE具有相关性。我们早先对SLE患者Aiolos基因mRNA及蛋白表达研究发现，SLE患者Aiolos基因的mRNA及蛋白明显降低，且与SLE活动指数呈一定的相关性[16-17]。提示Aiolos基因的表达与SLE相关，因此，我们通过研究贵州汉族人群SLE患者Aiolos的多态性，进一步认识Aiolos基因与SLE的关系，同时也为分子水平诊治SLE提供一定的理论依据。

越来越多的证据表明Aiolos基因在SLE 发病机制中有重要作用，与其他自身免疫病如类风湿关节炎等易感性也相关。美国近年的一项多种族全基因组关联分析(GWAS)研究[18]提示Aiolos基因中的rs8079075、rs9913957、 rs8076347 与欧洲SLE和非裔美国SLE均具有相关性，在亚洲人群中未发现多态性位点，本研究我们也选取了上述3个SNP位点进行重测序，均未发现多态性位点。本研究我们首次对贵州汉族人群Aiolos rs9909593、rs9635726及rs12150079位点进行多态性分析，结果显示贵州汉族SLE 患者这3个SNP位点基因型和等位基因频率与正常健康人群差异无统计学意义(P>0.05)，在多个遗传模式(加性、隐性、显性)下，利用logistic回归模型分析显示两组间差异均无统计学意义(P>0.05)；联合基因型进一步分析发现，rs12150079与rs9635726、rs9909593存在完全连锁不平衡，rs9635726与rs9909593存在强连锁不平衡，5单体型(ACG、GCA、GCG、GTA、GTG)频率在SLE组及健康对照组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)，同时非条件logistic回归分析显示，各单体型与SLE发病均无关。在叶丽霞等[19]研究中发现了rs9909593、rs9635726位点与SLE存在关联，与本研究结果不一致；Cai等[20]研究中rs12150079位点与SLE不存在关联，与本研究结果一致。

本研究我们只选取了3个标签SNPs，不能完全代表Aiolos基因。虽然本研究并未发现上述3个标签SNPs与贵州汉族SLE疾病有相关性，但不能完全排除Aiolos基因与中国汉族SLE疾病的相关性，仍需全面研究该基因的遗传变异，还需要进一步对Aiolos基因其他多态性位点进行全面分析，从而深入探索Aiolos基因与中国汉族SLE疾病的关系。由于本研究的选取SNP位点及研究对象数较少，仅对单个位点进行关联分析研究，基因-基因交互作用研究仍有待进一步开展，结果仍需今后进一步在不同地区、不同民族以及大样本人群中进一步验证。