江西农村与城镇耐药结核分枝杆菌分子特征的比较*

熊光初， 陈嫱， 章琪， 罗东， 刘涛， 彭亦平， 陈开森△

江西省胸科医院 1检验科， 3呼吸科(江西南昌 330006)； 2南昌大学第一附属医院检验科 (江西南昌 330006)

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis, TB)是重要的传染性病原体，其导致的结核病(tuberculosis)仍然是重要的公共健康问题。据中国2010年结核病流行病学抽样调查[1]，我国结核病分布表现为西部高于东部，农村高于城镇人群的特点。江西省处于我国的中东部地区，经济发展欠发达，农村与城镇发展不平衡，了解农村及城镇患者结核菌的分子特征，特别是耐药结核菌，其结果对于针对性地制定结核的防控措施具有重要价值。目前结核菌分子流行病学研究方法较多[2]。结核分枝杆菌多位点数目可变串联重复序列(MIRU-VNTRs)因其操作容易、结果稳定及实验室间易于比较常被采用。本研究对我院近年来分离的371株耐药结核菌进行15位点MIRU-VNTRs分型研究，旨在了解江西省不同来源耐药菌株的分子特征；同时采用RD105基因缺失鉴定为北京基因型[3-4]，为了解江西省不同来源耐药结核菌的耐药方式和分子特征，及后续防控方法提供基础。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集江西省胸科医院2014年1月至2017年12月住院患者371株痰培养耐药结核菌，所有结核菌培养均采用L-J培养基。标准结核菌株H37Rv为实验室自留，由中国CDC参比实验室提供。实验前菌株-80℃保存。

1.2 药敏实验 培养阳性的结核菌做一线结核药敏试验，包括异烟肼(INH)、利福平(RIF)、乙胺丁醇(EMB)和链霉素(SM)，检测方法为绝对浓度法。药物浓度及结果判断参照文献[3]。

1.3 北京家族菌 采用多重PCR技术，北京家族菌株表现为特征性的RD105片段缺失。模板提取、引物设计、PCR反应条件及结果判读参照文献[3]。

1.4 基因分型 本研究采用15位点MIRU-VNTRs，各位点引物、各位点的反应条件及结果判读参照文献[5]。

1.5 结果分析 非北京家族扩增产物为1 466 bp，而北京家族菌株的扩增产物为761 bp。MIRU-VNTRs各位点电泳结果换算成重复数如文献报道[5]，各位点分辨率计算及多态性程度判断见文献[6]。簇的定义及近期感染最小估计值的界定参照文献[3]。

2 结果

2.1 基本情况 371株菌中，农村户籍患者294株，城镇户籍患者77株，所有菌株都对至少一种一线抗结核药物耐药，耐药方式见表1。

表1 江西耐药结核患者药敏结果 株

2.2 北京家族菌株 本研究共分离到北京家族菌318株，非北京家族菌54株，北京家族菌为85.71%(318/371)，其中农村患者为86.05%(253/294)，城镇患者为84.42%(65/77)。

2.3 聚类分析 参照www.miru-vntrplus.org提供的方法，371株菌共计分33个簇及279个孤立株，其中完全由农村患者构成23个簇，完全由城镇患者构成7个簇，即包括农村又包括城镇患者13个簇。

2.4 位点多态性 农村来源菌株中，高度分辨率位点为MIRU26和Mtub04；中度分辨率位点为MIRU10、Qub11b、Qub26和MIRU16；低度分辨率位点为ETRE、Mtub39、Mtub30、ETRA、ETRD、MIRU40、Qub4156、Mtub30和ETRC。城镇来源菌株中，高度分辨率位点为MIRU26和Qub26；中度分辨率位点为MIRU10和Mtub04；低度分辨率位点为ETRC、ETRD、MIRU40、MIRU16、Mtub21、Qub11b、ETRA、Mtub30、ETRE、Mtub39和Qub4156。不同来源菌株间位点分辨率的结果见表2。

2.5 近期感染最小估计值 农村人员近期感染传播率为18.03%，城镇人员近期传播率为15.58%，两者间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

本研究收集了我院近年来耐药非重复结核菌371株，由于该院患者来源于全省各地，故菌株的分子特征可代表江西耐药结核菌的分子特征。

中国是全球5个主要耐药结核高负担国家之一，2017年WHO结核报告显示我们耐药结核菌已经超过印度，处于第1位。据2010年卫生部公布的《全国结核病耐药基线调查报告》，我国涂阳肺结核患者结核菌耐药率高达43.8%[7]，据此估算，我国每年新发耐药结核患者56.0万[1]。另据近年江西省有关结核菌的流行病学调查结果：江西地区耐药结核菌分离率高于全国平均水平[8]。参照近年来江西省人口数量、人群分布、结核菌分离率及耐药状况，江西地区耐药结核人群总数保有量估计超过10万人。了解这些患者结核菌的来源、耐药模式及分子特征对江西地区结核的控制及预防具有重要意义。

近年我院耐药结核菌的人群资料表明，感染患者主要来源于农村，城镇户籍人口明显少于农村，这与江西是农业大省有关。耐药模式表明农村地区耐单药结核菌107株、耐2药结核菌87株及耐3药结核菌97株，城镇地区则分别为27、29和30株，结果表明江西地区结核耐药患者耐多药常见，甚至出现4株菌对4种一线抗结核药物耐药，耐药率高的部分原因可能是我院为结核病治疗的上级医院，多为复治或治疗失败患者[8]。

表2 371株菌的各位点遗传差异及分辨指数 菌株数

分子流行病学已广泛用于结核菌的近期传播调查，其原理是某一地区短时间内(通常3年)结核菌具有相同分子标识，则认为相互间可能具有传播关系，本研究采用国际通用的15位点MIRU-VNTRs分型分析这些耐药菌株。结果显示：HGDI值较高，表明具有高的分辨率，表明15位点MIRU-VNTRs对本地区耐药结核菌可以很好地定义菌株间传播关系。多种研究表明北京家族菌是我国主要的流行株，本结果也表明江西地区流行结核菌也以北京基因型菌株为主且高于周边地区，例如湖南、浙江及福建[9]。有研究认为经典的15位点MIRU-VNTRs对北京家族菌株分辨率较低，然而另有研究认为该位点组合分型技术可用于北京基因型的分型研究[10]。我们的分型结果表明，虽然各个位点的分辨率存在较大差异，但总分辨率为0.996 4。

基因分型的意义是调查菌株间是否存在近期传播关系。感染者具有相同的基因型提示患者可能是近期被同一传染源所感染；单一基因型表提示患者可能是内源性复燃而导致。本次研究中371菌株的成簇率为28.64%，高于Liu等[11]研究结果。虽然MIRU-VNTR分型研究的基础是感染菌株间具有相同的基因型，但具有相同基因型的结核菌可能并没有流行病学联系，且全基因组测序分析也证明了MIRU-VNTR分型技术增高患者间感染在结核病发生中的作用[12]。根据农村及城镇患者来源菌株的比较研究，发现仅农村结核间的传播率(18.03%)几乎等同于仅城镇结核间的传播率(15.58%)，表明两类人群间无差异。由于低成簇率，故认为江西地区患者耐药结核菌感染以复燃为主，故治疗中应增大患者药物使用的依从性。总之，江西省耐药结核患者较多，感染以复燃为主，在人群的防治中，应尽可能地发现传染源并采取多种措施控制传播的发生。