牛膝活性成分β-蜕皮甾酮通过Akt信号干预地塞米松诱导的骨细胞凋亡

魏元基 李峻昊 王利波 王成龙 戴薇薇

上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032

临床上糖皮质激素(glucocorticoid, GC)被广泛用于抗炎、抗过敏、抗中毒、抗休克的治疗，但易导致骨质疏松症的发生[1-3]。GC诱导的骨质疏松症(glucocorticoid induced osteoporosis, GIOP)是继发性骨质疏松症的最常见病因。临床流行病学研究显示，在美国约50%风湿性关节炎患者长期使用GC，治疗数周后，骨量开始流失，最初数月内的骨量丢失迅速，达5%～15%。长期接受GC治疗(半年以上)的患者骨质疏松发生率高达30%～50%[3]。

β-蜕皮甾酮(β-Ecdysone，β-Ecd)为牛膝根内主要活性成分之一。本研究发现，β-Ecd有助于改善去势小鼠的脊椎骨小梁体积与骨强度，一定剂量的β-Ecd可以提高成骨细胞的活性而抑制破骨细胞的活性[4]。骨细胞在骨组织中占90%～95%，形成遍布骨基质的三维骨细胞网络(osteocyte network)。其被认为是机械应力感受细胞及活跃的旁分泌细胞。但近年研究表明，骨细胞可能是骨重塑的调节中心，起着包括骨重塑的启动、骨吸收的抑制以及骨形成调节等的重要作用[5]。本实验研究β-Ecd对Dex诱导的骨细胞凋亡的干预作用，并检测Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad蛋白的表达，以探讨β-Ecd作用于骨细胞可能的分子途径。为β-Ecd干预GIOP的作用机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 药物和试剂

β-蜕皮甾酮(批号：10020231，规格: 99%，分子量: 480.6，上海同田生物技术有限公司)，地塞米松(批号：D9184，分子量: 434.5，Sigma公司)，α-MEM 培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，青链霉素(Hyclone公司)，PI3K抑制剂LY294002(LY，编号：9901S，Cell Signaling Technology 公司)，Annexin V- FITC/PI(编号：V13241，Thermo fisher公司)，BCA蛋白浓度检测试剂盒(编号：P0010，碧云天公司)，Akt1、P-Akt-T308、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad、GAPDH 单克隆兔抗小鼠抗体(Cell Signaling Technology公司)，羊抗兔 IgG-HRP 二抗(Santa Cruz公司)，ECL显色试剂盒(批号：P0 018 A，上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 仪器

CO2培养箱(型号：FORMA STERI-CYCLE i160，Thermo Scientific公司)，生物安全柜(型号：MSC 1.8，Thermo Scientific公司)，电泳仪与凝胶垂直电泳系统(型号：Mini Protean，美国 BIO-RAD 公司)，酶标仪(型号：Synergy2，Bio Tek公司)，流式细胞仪(型号：C6，BD 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1MLO-Y4骨样细胞给药与分组：MLO-Y4骨样细胞以α-MEM培养基(2.5% 胎牛血清+2.5% 小牛血清+1%青链霉素)于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞密度达到80%～90%时，分别以Dex、LY(PI3K抑制剂)、不同浓度的β-Ecd进行干预，将细胞分为6组：①正常组；② 10 μmol/L Dex模型组；③ 10 μmol/L Dex+10 μmol/L β-Ecd组；④ 10 μmol/L Dex+10 μmol/L β-Ecd+50 μmol/L LY294002组；⑤10 μmol/L Dex+0.1 μmol/L β-Ecd组；⑥ 10 μmol/L Dex+0.1 μmol/L β-Ecd+50 μmol/L LY294002组。作用时间为48 h。

1.3.2Annexin V- FITC/PI 法检测凋亡：MLO-Y4骨样细胞用0.25%胰酶消化，洗涤，1300g，4 ℃离心5 min，收集。加入 5 μL FITC 标记的 Annexin- V 室温避光15 min，再加入PI，避光反应5 min 后，加入5 μL缓冲液(binding buffer)，进行流式细胞凋亡检测(N=3)。

1.3.3Western-Blot检测Dex、β-Ecd作用下Akt、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad、GAPDH蛋白表达：提取各组细胞总蛋白，以BCA法进行蛋白定量测定，变性蛋白，SDS-PAGE 电泳，转膜，封闭，分别加入稀释后的一抗(Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43、Caspase9、Bad、P-Bad稀释比例 为1∶200，GAPDH稀释比例为1∶400)，置于4 ℃冰箱过夜，PBST 洗涤8次，每次5 min；将PVDF膜放入含辣根过氧化物酶标记的稀释二抗(HRP Goat anti-Rabbit IgG，对磷酸化一抗稀释比例为1∶3000，对其余一抗稀释比例为1∶15000)，室温孵育1 h，PBST洗涤8次，每次5 min。ECL 试剂显色，凝胶图像分析仪曝光、拍照。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 流式细胞仪Annexin V- FITC/PI 法检测各组细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡结果(图1)显示：与正常组比较，造模组(10 μmol/L Dex)凋亡率升高；与造模组比较，用药组(10 μmol/L β-Ecd，0.1 μmol/L β-Ecd)降低了凋亡率；而加入抑制剂LY(第4、6组)凋亡率明显升高。同时发现，第4组(10 μmol/L β-Ecd)凋亡率比第6组(0.1 μmol/L β-Ecd)低。

图1 流式细胞仪检测凋亡结果Fig.1 Apoptosis results detected with flow cytometry

图2 MLO-Y4细胞凋亡率与正常组比较， *P<0.05；与造模组比较，△△ P<0.01。Fig.2 Apoptosis rate of MLO-Y4 cells

2.2 Western-Blot检测各组细胞相关基因蛋白表达

与正常组比较，Dex组Akt1、CX43蛋白表达降低；与造模组(10 μmol/L Dex)比较，β-Ecd(10 μmol/L，0.1 μmol/L)使Akt1、CX43蛋白表达增强；

与给药干预组比较，加入LY后，Akt1、P-Akt(Thr308)、CX43蛋白表达均降低。

表1 各组细胞相关蛋白表达结果Table 1 The results of cell-associated protein expressions in each

注：与正常组比较*P<0.05；与造模组比较△P<0.05。

Caspase9、Bad是促进凋亡的因子，Bad磷酸化(P-Bad)则抑制Bad活性。与正常组比较，Dex组Caspase9、Bad表达增强、P-Bad表达减弱，提示诱发凋亡；与造模组(10 μmol/L Dex)比较，β-Ecd(10 μmol/L，0.1 μmol/L)减弱Caspase9的表达；加入抑制剂LY组(第4、6组)，Caspase9、Bad表达明显减弱、P-Bad表达明显升高，且第4组、第6组表达因β-Ecd浓度不同而有差异。

图3 Western-Blot检测结果Fig.3 Results of Western-Blot

3 讨论

GC广泛应用于临床，但同时也伴随不良反应，如导致骨质疏松的发生。目前认为，骨形成的抑制和骨细胞的凋亡在糖皮质激素诱导的骨质疏松症的发病机制中起到一定且关键的作用，而在GC使用期间骨吸收的变化是可变的[6]。过量的GC抑制Akt蛋白的活性，从而抑制了骨形成[7]；高剂量或者长时间使用GC则影响骨的水化、骨内血管及骨的强度而导致骨细胞的凋亡[8]，约25%的患者由于凋亡的细胞的聚集而发生骨坏死，从而增加股骨头塌陷的风险[9]。本研究结果发现，高浓度(10 μmol/L)Dex使MLO-Y4骨细胞凋亡率升高。

有学者发现，衰老会导致骨细胞凋亡增加[10]。牛膝活性成分β-蜕皮甾酮具有明显的延长果蝇寿命、降低MDA(malonaldehyde，丙二醛)、升高SOD(superoxide dismutase，超氧化物歧化酶)活性等抗衰老作用[11]。

CX43(骨连接蛋白)是骨细胞中表达最丰富的半通道蛋白，由两个并列连接子或半通道形成的间隙连接调节骨细胞、成骨细胞和破骨细胞之间的细胞间通讯，因此在骨形成和骨重塑中发挥关键作用[12]。有实验发现，Dex可诱导CX43降解，而Akt磷酸化则抑制CX43降解，CX43降解可能导致骨质流失[13]。PI3K/Akt信号通路在调节细胞增殖、生长和凋亡中起重要作用，本研究结果表明，10 μmol/L地塞米松使MLO-Y4骨细胞Akt1、CX43蛋白表达降低，而β-Ecd使Akt1、CX43蛋白表达升高。LY294002是PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂，体外和体内实验表明LY通过抑制Akt磷酸化而抑制Akt蛋白活性并增加凋亡率[14]。研究发现，β-Ecd并不能使LY降低的Akt1蛋白表达升高。由此反证β-Ecd在骨细胞中可能通过Akt途径对Dex诱导的凋亡起干预作用。

据报道线粒体是调节细胞凋亡的关键。激活Bad使线粒体通透性提高，细胞色素C从膜间隙释放到细胞质中，最终激活Caspase酶介导的凋亡程序。而P-Bad与分子伴侣蛋白14-3-3结合，能抑制Bad的表达[15-16]。研究发现，10 μmol/L Dex抑制骨细胞Bad蛋白的磷酸化，促进Bad、caspase9蛋白的表达，而一定浓度的β-Ecd干预则使Caspase9蛋白的表达降低。表明β-Ecd 可能通过线粒体凋亡途径抑制Dex诱导的骨细胞凋亡。

综上，牛膝活性成分β-蜕皮甾酮通过激活骨细胞中的PI3K/Akt信号通路，从而干预Dex诱导的骨细胞凋亡，该过程可能依赖于线粒体凋亡途径。