跑步运动配合银杏叶提取物摄入对去卵巢肥胖骨质疏松大鼠骨密度、血脂和抗氧化能力影响研究

2019-03-26仇业鹏张庭然

中国骨质疏松杂志 2019年3期

仇业鹏张庭然

1. 重庆师范大学体育与健康科学学院，重庆 401331 2. 西南大学体育学院，重庆 400715

在《美国医学会杂志》 (The Journal of theAmerican Medical Association，JAMA)和《新英格兰医学杂志》 (The New England Journal of Medicine，NEJM)等权威期刊频频刊登代谢综合征 (metabolic syndrome， MS) 相关研究[1-2]。在流行病学领域MS亦是研究热点[3]。MS是多种代谢成分紊乱集中体现的病理状态，主要包括糖、脂类、蛋白质、尿酸和骨代谢紊乱等，MS能够显著加速肥胖、高血脂、高血压、2型糖尿病进程，同时会大幅度增加心脑血管疾病的患病风险[4-5]。Daudt、Lim等[6-7]研究表明，绝经期女性被认为MS 的易感人群，MS在绝经期妇女中患病率约为33%～42%。MS中高血压、糖尿病、心脑血管等表现由于其直接的危险性和危害性受到较高的关注，相关研究也较多。而肥胖和骨代谢异常由于其危害性需要较长时间的积累方能显现，所以受关注程度较低。妇女绝经后由于雌性激素水平下降，体内激素环境呈现明显改变，绝经妇女经常出现内脏脂肪和皮下脂肪的堆积增加，从而导致肥胖的发生，与肥胖伴生的高血脂症则是心脑血管疾病的重要危险因素。女性进入绝经期，由于雌激素下降，骨量流失加剧，髋部、股骨和腰椎等位置骨量流失较为严重，容易出现骨质疏松现象。绝经期女性往往会伴随肥胖高血脂与骨质疏松发生。有研究认为这可能与雌激素下降和皮质醇上升有关[2]。适量运动被认为能够有效改善骨质，增加骨密度。而运动减肥一直以来是最被推崇的科学减肥方法。但是通过跑步改善骨量和骨密度，一般要连续运动35周以上才能实现[4]。在降低血脂方面，美国运动医学会的运动处方指南中提到，中低强度跑步运动同时配合清血脂类膳食添加剂降低血脂作用会显著优于单纯跑步[8]。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)是一种应用广泛的传统中药，主要有效成分为是银杏萜内酯类化合物和黄酮类化合物，GBE因其具有抗氧化、改善缺血心肌功能等功效，已被应用于心脑血管疾病治疗[9-10]。但随着有关GBE研究深入，发现GBE的应用远不止于此。有研究显示GBE能够显著提升骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同时能够抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化[11]。进一步研究发现摄入GBE对骨质疏松大鼠的成骨有促进作用，可以加速骨小梁的形成，增强骨密度[12]。也有研究显示GBE能够明显降低大鼠血清总胆固醇水平，并且够缓解高脂饮食导致的心血管炎症[13]。但目前将运动联合GBE摄入对人或动物降低血脂或改善骨健康的研究尚少。但运动和GBE在降低血脂或改善骨健康方面具有类似作用，联合使用有可能形成叠加效应，从而增加治疗效果或者缩短治疗时间。因此，本研究将跑步运动配合银杏叶提取物摄入作为干预方案，以去卵巢肥胖骨质疏松大鼠为研究对象，探讨跑步运动配合银杏叶提取物摄入对骨密度、血脂和抗氧化能力的影响。为探索改善绝经期肥胖骨质疏松妇女的骨健康、脂代谢提供有效参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：本实验从重庆医科大学下属动物实验中心(SCXK(渝) 2017-0023)购得12周龄未经产SPF级健康雌性Sprague Dawley(SD)大鼠80只，体重为(270.4±18.6)g。所有SD大鼠进行分笼饲养，大鼠自由饮水饮食，在适应期饲养期间，饲料采用符合国家标准啮齿类动物饲料进行喂食，动物房内温度保持22～25 ℃，相对湿度保持45%～55%，明暗分期为12/12 h，所有大鼠实验前均未在动物跑台上进行过运动。本研究中对实验动物处理完全符合我国科学技术部办公厅2004年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.1.2实验试剂：GBE(总黄酮醇苷含量26.2%、萜类内酯含量为7.8%)由江苏金纳多生物科技有限公司生产，配置过程时称取GBE，将银杏叶提取物溶解于生理盐水中(50 g /L)并且进行2 min研磨混悬，在4 ℃ 避光保存。戊巴比妥钠，上海信裕生物科技有限公司生产。青霉素钠，河北石家庄制药集团四厂生产。大鼠骨钙素(OC) 检测试剂盒-ELISA检测试剂盒，美国R&D Systems生物科技有限公司生产。大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 检测试剂盒-ELISA检测试剂盒，美国R&D Systems生物科技有限公司生产。雌二醇(E2)检测试剂盒-ELISA检测试剂盒，美国R&D Systems生物科技有限公司生产。丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒-ELISA检测试剂盒，美国R&D Systems生物科技有限公司生产。超氧歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒-ELISA检测试剂盒，美国R&D Systems生物科技有限公司生产。谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)检测试剂盒-ELISA检测试剂盒，过氧化氢酶(catalase, CAT)检测试剂盒-ELISA检测试剂盒，美国R&D Systems生物科技有限公司生产。

1.1.3实验设备：美国Johnson&Johnson 公司DT-60Ⅱ型血液分析仪，上海分析仪器公司UV-8000ST触屏版双光束紫外可见分光光度计，日本日立公司HITACHI-7000全自动生化分析仪，湖南湘仪集团CTK-130C低温离心机，美国AWARENESS 公司Statfax 4200 酶标仪，韩国InAlyzer公司DXA双能 X 线骨密度仪，江苏赛昂斯公司SA109动物跑台。

1.2 研究方法

1.2.1实验设计：第1步：购回SD大鼠后，进行1周适应性笼内饲养，自由饮食。第2步：将大鼠随机分为去卵巢高脂组和对照组，去卵巢高脂组进行卵巢切除手术，对照组进行假手术，术后去卵巢高脂组进行高脂饲料喂食，对照组进行正常喂食，共进行6周，将接受切除卵巢手术和高脂喂食的的大鼠又随机分为模型组、银杏叶组、运动组、银杏叶+运动组，接受假手术和正常喂食的大鼠归为假手术组。第3步：进行12周干预，干预方案见表1。第4步：全部干预结束后，将各组大鼠分组置入代谢笼，采集24 h的尿样，尿样采集结束后，进行大鼠的腹腔静脉取血，对大鼠进行骨扫描、血液生化指标检查、骨代谢标志物检查。

1.2.2制造动物模型：大鼠适应性饲养结束后，将大鼠随机分为切除卵巢高脂喂食组(ovariectomized，OVX组)和对照组，数量分别为60只和20只。将80只SD大鼠利用50 mg /kg戊巴比妥钠(0.1 g/kg)进行腹腔注射麻醉，剔除体毛，在大鼠脊柱左右侧剪开背部肌肉约1.5 cm切口，对大鼠进行卵巢切除，对照组大鼠只切除卵巢附近脂肪组织。最后利用可被大鼠自体吸收的羊肠线进行刀口缝合，完成手术后对大鼠腹腔注射80万IU/kg青霉素钠，1次/d，连续注射7 d，以防出现术后感染。术后切除卵巢高脂喂食组进行高脂饲料喂食，对照组进行正常饲料喂食，进行6周干预。本次造模中被切除卵巢和高脂喂食的60只大鼠均存活、精神良好，全部造模成功。假手术正常喂食的20只大鼠，全部存活且状态良好。

1.2.3分组方案：术后6周后，停止高脂饲料喂食，进行正常饲料喂食。将进行假手术正常饲料喂食处理的对照组的20只大鼠定为假手术组(sham-operated，SO组，n=20)；接受去卵巢手术高脂饲料喂食的大鼠随机分为模型组(model，M组，n=15)、跑步运动组(run，R组,n=15)、GBE组(Ginkgo biloba extract,G组，n=15)、GBE+跑步运动组(Ginkgo biloba extract+run,GR组,n=15)。其中G组按照100 mg /(kg·d)灌胃给予相应的药物，正常饲养不进行运动，GR组与G组采用相同给药方式并进行运动，R组、S组、M组按与G组相同体积0.5% CMC-Na进行灌胃，其中R组每天进行与GR组相同运动，S组、M组进行正常饲养，不运动。所有实验大鼠每天灌胃1次，每周灌胃6 d，连续给药12周。在12周干预后所有大鼠皆存活，未出现死亡，且精神状态良好。

1.3 观察检测指标

1.3.1观测大鼠健康及生活状态指标：自大鼠购回后，专人观察所有大鼠适应状况、大鼠术后伤口恢复、精神、饮食、体重、排泄等状况，每周记录大鼠体重。

1.3.2骨密度、骨代谢检测指标：①12周干预结束后，本研究利用韩国InAlyzer-DXA双能 X 线骨密度检测仪中RCP活体小动物扫描模式对大鼠左腿股骨进行检查。②12周干预结束对大鼠进行后腹腔采血，常温(22 ℃)下血样静置1 h，利用低温高速离心机，在4 ℃下对血液以4 000 r/min 离心8 min。利用酶联免疫法-ELISA检测血清骨钙含量(osteocalcin，OC)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)水平；利用生化分析仪检测血清中钙(Ca)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、磷(P)水平。

1.3.3激素、血脂、抗氧化指标检测：本研究大鼠经12周实验干预后，在24 h内，通过腹腔取血采集约20 mL的血样，并保存于EDTA 抗凝采血管中，按

表1 分组方案表Table 1 Grouping scheme

次序进行编号，利用低温高速离心机，在4 ℃下对血液以4 000 r/min 离心8 min。采用酶联免疫法-ELISA酶法检测血清雌二醇(Serum estradiol，E2)、检测丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的水平。利用全自动血液分析仪、紫外分光度仪检测血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol LDL-C)。

1.4 统计学处理

本研究利用SPSS18.0统计软件进行数理统计分析。通过描述性分析、多因素方差分析检验运动因素和摄入银杏叶提取物因素对大鼠各项指标的影响。检测中，当交互作用具有统计学意义，则进行Tukey method检验。本文设置显著水平为α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠体重变化结果

大鼠体重变化结果见表2。

表2 大鼠体重变化(g，n=80)Table 2 Changes in body weight (g，n=80)

注：假手术组(S组)、模型组(M组)、运动组(R组)、银杏组(G组)、银杏运动组(GR组)；与S组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05。

表2显示：①在购回进行适应性饲养后，大鼠体重组间差异并无统计学意义，P>0.05；②手术后6周，进行干预前，去卵巢高脂喂食的M组、R组、G组、GR组大鼠体重显著高于S组大鼠；说明肥胖大鼠模型构建成功；③在干预后3、6、9、12周M组大鼠体重显著高于S组，P<0.05，R组、G组、GR组大鼠体重有逐渐上升趋势，但是在3、6、9、12周均显著低于M组，P<0.05。④当干预进行至第9周、第12周R组与GR组大鼠体重高于S组但差异无统计学意义，P>0.05。

2.2 大鼠骨密度和雌二醇测量结果

大鼠骨密度和雌二醇测量结果见表3。

表3 各组骨密度和血清雌二醇水平测试结果(n=80)Table 3 Comparison of BMD and E2 among groups(n=80)

注：与S组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05。

表3显示：①M组大鼠BMD、血清E2水平显著低于S组大鼠，P<0.05。②R组、G组GR组大鼠BMD、血清E2水平显著高于M组(P<0.05)，虽低于S组，但差异无统计学意义，P>0. 05，GR组BMD、血清E2水平高于R组、G组，但差异无统计学意义，P>0.05。

2.3 大鼠骨质代谢测量结果

大鼠骨质代谢测量结果见表4。

表4 OC、ALP、DPD /Cre、Ca、P结果(n=80)Table 4 Measuring result of OC, ALP, DPD / Cre, Ca, P(n=80)

注：与S组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05。

表4显示：①M组大鼠血清OC、ALP、尿液DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平显著高于S组、R组、G组和GR组，P<0.05。S组大鼠血清OC、ALP、尿液DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平与R组、G组、GR组差异不具有统计学意义，P>0.05。②大鼠血清Ca、P水平方面，M组、S组、R组、G组、GR组组间差异无统计学意义，P>0.05。

2.4 氧化指标测量结果

氧化指标测量结果见表5。

表5 大鼠血清CAT、GSH-PX、MDA、SOD测量结果(n=80)Table 5 Measuring result of CAT、GSH-PX、MDA、SOD(n=80)

注：与S组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05；与R组比较，cP<0.05；与G组比较，dP<0.05。

表5显示：①M组大鼠MDA水平显著高于S组、R组、G组和GR组，P<0.05；S组大鼠MDA水平显著低于与R组、G组、GR组，P<0.05，R组、G组、GR组组间差异不具有统计学意义，P>0.05。②M组大鼠CAT、GSH-PX水平显著低于S组、R组、G组和GR组，P<0.05；S组大鼠CAT、GSH-PX水平显著高于与R组、G组、GR组，P<0.05，GR组大鼠CAT、GSH-PX水平显著高于与R组、G组，P<0.05， R组、G组组间差异不具有统计学意义。③M组大鼠SOD水平显著低于S组、R组、G组和GR组，P<0.05；S组、R组、G组和GR组组间差异则无统计学意义，P>0.05。

2.5 大鼠血脂测量结果

大鼠血脂测量结果见表6。

表6显示：①M组大鼠血液TG、TC水平显著高于S组、R组、G组和GR组，P<0.05；S组大鼠血液TG、TC水平显著低于与R组、G组，P<0.05，但与GR组比较差异不具有统计学意义，P>0.05。

表6 血脂测量结果Table 6 Measuring result of blood lipid(mmol/L)

注：与S组比较，aP<0.05；与M组比较，bP<0.05。

②M组大鼠血液LDL-C水平显著高于S组、R组、G组和GR组，P<0.05；S组大鼠血液LDL-C水平与R组、G组、GR组比较，差异不具有统计学意义，P>0.05。

3 讨论

流行病学研究显示MS在女性绝经后发病率升高，其中绝经后骨质疏松和中老年肥胖是其中重要表征[2]。骨质疏松(OP)是一种多原因引发的骨量丢失、骨结构退化导致骨脆性增加的全身性骨代谢疾病[6]。骨质疏松主要分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松，原发性骨质疏松占大多数，原发性骨质疏松又分为老年性骨质疏松、绝经后骨质疏松、特发性(少年)骨质疏松。其中绝经后骨质疏松较为常见，其原因主要是绝经后卵巢功能退化、机体雌激素水平降低，骨代谢升高、骨量流失加剧。同样由于雌激素水平下降，导致脂代谢速率降低，血脂、内脏脂肪、皮下脂肪堆积，所以中老年女性肥胖和高血脂较为常见[14]。本研究利用未经产的雌性SD大鼠进行双侧卵巢摘除和高脂喂食建立绝经骨质疏松并发肥胖模型，通过跑步运动联合银杏叶提取物摄入进行12周干预，研究该方案对去卵巢骨质疏松并发肥胖大鼠骨密度、骨代谢、脂代谢、抗氧化相关指标的影响。

3.1 不同干预方案对大鼠体重和脂代谢的影响

本研究中在进行干预前去卵巢手术联合高脂喂食的M组、R组、G组、GR组大鼠体重显著高于S组大鼠，M组、R组、G组、GR组大鼠体重与先前有关肥胖大鼠模型的研究中大鼠数据比较后发现肥胖大鼠模型构建成功。但过去的研究中一般高脂喂食大鼠的模型建立[15]，需要8～12周，但本研究6周模型建立成功，这可能与本研究使用去卵巢大鼠有关，大鼠去卵巢后，雌激素水平下降，骨量流失增加，机体出于代偿机制，刺激体重增加。在此机制作用下，结合高脂喂食，导致肥胖大鼠模型形成较快。本研究发现在干预过程中R组、G组、GR组大鼠体重虽然仍呈上升趋势，但其上升速度显著低于M组，所以可以认为跑步干预、摄入GBE干预、跑步+GBE干预能够降低肥胖的发生，在干预的第12周R组与GR组大鼠体重高于S组，但差异无统计学意义，表明跑步运动是体重变化的主要影响因素。

3.2 不同干预方案对大鼠骨密度、骨代谢的影响

骨质疏松症的成因复杂，其中成骨细胞与破骨细胞间动态平衡遭受破坏是被公认的重要成因，当成骨细胞分化作用减弱，同时破骨细胞分化作用增强时，骨吸收超过骨生成，就会导致骨质疏松发生。骨的转换过程能够通过测定间接标志物，反映成骨细胞和破骨细胞的活性。血清中 OC 水平可作为评估骨转换率及骨形成的特异性标志物，OC 则会参与成骨细胞分化及基质的矿化全过程。此外本研究还选定尿液DPD、CA、P等生化指标，代表了骨组织中无机物的变化状态，通过以上指标全面反映骨代谢情况。本研究发现：经过12周干预S组、R组、G组和GR组血清OC、ALP、尿液DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平均明显低于M组大鼠，而R组、G组、GR组与S组在以上指标方面差异没有统计学意义，M组OC、ALP水平高于其他组则说明，M组大鼠骨转换率较高，DPD/Cre、Ca/Cre、P/Cre水平高于其他组说明，骨吸收率较高，M组大鼠破骨作用增强。而进行干预的R组、G组和GR组骨代谢指标虽略高于S组但差异没有统计学意义，说明经过跑步干预或者摄入GBE能够调节去卵巢肥胖大鼠的骨代谢平衡，降低骨转换率，发挥抗骨质疏松的作用。

骨密度是骨骼强度的一个重要指标，也是用来判断骨质疏松、评价骨质健康状况重要指标。去卵巢后18周，M组大鼠BMD、血清E2水平显著低于S组大鼠，再结合大鼠体重变化可判断本研究去卵巢骨质疏松肥胖大鼠模型构建成功。R组、G组GR组大鼠BMD、血清E2水平显著高于M组，说明GBE摄入对于骨密度具有改善作用，此结果与Mokuda等[16]的研究结果相似。Pan等[17]也观察到 GBE摄入能够加速骨形成促进骨折愈合。GBE能够改善骨密度的机制可能是GBE能促进RAW264.7细胞凋亡，使RANKL诱导的RAW264.7细胞的G0-G1期阻滞缩短，从而抑制破骨细胞分化、阻碍骨吸收作用。GR组骨密度高于G组和R组，并接近显著水平。这现象说明跑步配合GBE摄入能够效果叠加，跑步配合GBE对于骨密度的改善更为显著，先前在Mokuda等[16]的研究中采用运动加膳食添加剂方案取得较好效果，本研究与该研究结果类似。本研究中跑步运动配合银杏叶提取物摄入对骨密度具有明显改善作用，在跑步运动配合银杏叶提取物摄入中长期干预下，绝经骨质疏松肥胖模型大鼠骨密度能够接近正常大鼠骨密度。

3.3 不同干预方案对大鼠抗氧化指标的影响

氧化应激(oxidative stress，OS)是指机体受到各种有害外界刺激情况下，体内氧化与抗氧化的动态平衡被打破，体内高分子活性物质过多，超过细胞氧化物的清除能力，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，从而导致组织损伤。氧化应激被认为是导致机体衰老和疾病的重要因素[8]。机体内存在的酶能够防御清除自由基如：SOD、CAT等。SOD、CAT、GSH-Px是抗氧化的重要检测指标，而 MDA为脂质过氧化最终产物。MDA、SOD、CAT、GSH-Px 是大多数研究采用的反应氧化应激水平和抗氧化能力的指标。本研究结果显示R组、G组和GR组MDA水平显著低于M组，而CAT、GSH-PX、SOD水平则显著高于M组，说明通过去卵巢肥胖骨质疏松大鼠利用跑步运动配合摄入GBE方案、单纯摄入GBE方案、跑步方案进行中长期干预治疗能够增加机体抗氧化能力。过去许多学者进行运动抗氧化方面研究，已经证实中低强度有氧运动能够提升机体抗氧化能力[18]。通过长期规律的运动，能够提升SOD、CAT、GSH-Px活性从而增加机体抗氧化能力，已经被大量研究证实[19]。程林认为，中低强度运动能够保持机体氧化应激，从而保持了SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性[20]。大量研究均证实生物类黄酮和多酚被认为可以有效清除体内的自由基，GBE主要成分即为黄酮类化合物，此外还含有银杏内酯、酚类。也有研究指出GBE能直接清除超氧阴离子及氧自由基，提升SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性降低血清活性氧含量和黄嘌呤氧化酶活性[11]。与通过跑步运动和摄入GBE增强抗氧化能力的机制不同，两种方法联合使用，抗氧化效果进一步提高。

3.4 不同干预方案对大鼠体重和脂代谢的影响

慢性代谢综合征中高血脂症为常见表征，高血脂是通常由于机体摄取脂肪过量或脂代谢障碍等所诱发的血浆中脂类物质浓度过高或持续升高的一种异常生理生化表现。大量流行病学研究证实，血液总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)水平与冠心病发病率显著正相关，HDL-C水平与脑卒中、冠心病、动脉粥样硬化疾病的发病率呈高度负相关。前文对于大鼠体重变化进行了探讨，体重变化虽能够一定程度反应脂代谢的情况，但目前对于脂代谢的常用指标为TC、TG、HDL-C、LDL-C，本研究发现经过12周干预M组大鼠血液TG、TC、LDL-C水平显著高于S组、R组、G组、GR组，S组大鼠血液TG、TC、LDL-C水平显著低于R组、G组，该现象表明跑步运动和摄入GBE均可降低血脂，达到改善脂代谢的目的。Hweta等[21]研究显示中低强度跑步运动能够显著降低总胆固醇、甘油三脂水平。Miguel等[22]研究显示18周有氧跑步运动能够显著降低LDL-C水平，提高HDL-C水平。本研究的跑步运动速度为0.7 km/h，属于中低强度运动，正是运动控制体重和降低血脂的最佳强度。跑步运动对于降低体重和血脂具有明显作用，这已经被大量研究证实，本研究结果也再次证实跑步对于血脂的调节作用。本研究中摄入银杏叶提取物组TG、TC、LDL-C水平显著低于M组，这表明GBE具有调节改善血脂的作用。先前文献报道，GBE能够降低高血脂大鼠血清中总胆固醇水平的作用。Chobanian等[23]认为GBE能够调节血脂是通过清除氧自由基和抗脂质过氧化作用机制实现的降脂。本研究结果显示GBE能够降低大鼠CAT、MDA，提升SOD、GSH-PX，说明GBE具有清除氧自由基和抗脂质过氧化的作用。本研究显示跑步+GBE摄入的方案，比单纯跑步或摄入GBE具有明显的调节血脂的效果，这说明跑步结合GBE摄入，能够产生叠加效应，是更高效的调节血脂方案。目前本研究主要集中于GBE提取物研究只涉及其中的一个环节，对于GBE调血脂的机制研究还比较少，值得进一步的研究。