SDF-1促进BMSCs迁移的研究进展

2019-03-27刘想忠李章华许海甲

中国骨质疏松杂志 2019年3期

刘想忠李章华许海甲

武汉大学附属同仁医院(武汉市第三医院)，湖北武汉 430000

骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是近年来发现的多能干细胞，存在于骨髓之中，含量在0.01%以下，属于成体干细胞的一种，具有多种分化能力及自我更新能力，在不同的诱导环境下可分化成种细胞，如成骨细胞，软骨细胞，心肌细胞及脂肪细胞等。且由于其取材方便，不违背伦理道德问题, 在体外易于培养，有稳定表型及传代能力，因此近年来关于将其应用于组织退行性疾病、组织器官损伤性疾病及遗传缺陷型疾病方面的研究越来越多[1-2]。

BMSCs在体外无诱导物培养环境下呈长梭形、紧密排列的旋涡状生长，其表面有很多抗原标记，如CD73、CD105、CD29、SH-3、SH-4、CD271、CD90、CD106、CD200。但阴性表达CD34、CD45、CD11b、CD19、CD14、CD79α[3-5]，其中CD34可用于分离纯化BMSCs[6]。研究发现将来源于同种或异种的BMSCs通过动脉、静脉或局部直接注射给受试者后，受试者并未发生免疫排斥反应，这表明BMSCs具有免疫抑制能力，可躲避受试者免疫系统的攻击。目前研究[9]表明BMSCs的免疫抑制能力可能与下面因素有关：①BMSCs表面主要表达主要组织相容复合体1(MHC1)，而不表达MHC2,调节机体系统的免疫微环境[7]；②免疫调节及抗炎作用：MSCs抑制树突状细胞、免疫淋巴细胞、自然杀伤细胞的成熟及对炎症因子的分泌[8]；③可抑制B淋巴细胞的增殖及浆细胞的分化。

研究[10]发现，经静脉、动脉及局部注射途径给予BMSCs治疗时，只有约2%～12%的细胞可以到达目标区域，且存活率很低，只能短暂的改善器官或组织功能，因此对其迁移/归巢机制进行研究就显得十分重要。BMSCs的迁移与很多因素有关，如糖浓度、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotein，MMP-2)、膜型基质金属蛋白酶(membrane type 1-matrix metalloproteinMTI-MMP)、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)等。不同细胞因子及信号轴之间相互影响，相互协调，其中SDF-1/CXCR4起着连接点的作用。本文拟对SDF-1促进BMSCs迁移的机制进行总结，为后续研究提供指导。

1 SDF-1及其受体CXCR4

1.1 SDF-1

SDF-1也被称为CXCL12，属于CXC-趋化因子家族的一员，它首先是从小鼠骨髓基质细胞分泌的因子中发现的，包括SDF-1α/CXCL12α和SDF-1β/CXCL12β两种，两者由同一基因序列编码，但外显子不同，分别由3个和4个外显子编码，差别源自选择性剪接，除SDF-1α比SDF-1β在羧基端少约4个氨基酸外，两者氨基酸组成相同，两者的cDNAs分别编码89和93个氨基酸，都含有四个保守的半胱氨酸残基形成两队双硫键构成其特殊结构。SDF-1的氨基酸序列在物种之间非常保守，在小鼠和人类之间相似性达99%。目前已知人类的SDF-1基因定位于10号染色体长臂，且在心、脑、肾等多种组织器官中表达[11-12]。CXCR4 是一种7次跨膜G蛋白偶联受体，又称CD184，CXCR4蛋白分子量包括66kDa和130kDa两种，可在多种细胞表达，包括循环中的单核细胞、CD34+造血祖细胞、内皮祖细胞及神经细胞。Wynn 等[13]发现CXCR4主要在BMSCs内表达，而在表面表达很少，当受到趋化因子SDF-1刺激时，其将移动到细胞表面。CXCR4曾被认为是SDF-1的唯一受体，但近年来发现[14-16]SDF-1还有另一个受体CXCR7(C-X-C chemokine receptor 7)，其曾被称为孤儿受体—RDC1，在人类和小鼠中的相似性达95%，可在多种细胞中表达，如神经细胞、免疫细胞、肿瘤细胞及血管内皮细胞，在心肌发育、肿瘤生长、代谢及侵袭方面具有重要作用，并且其与SDF-1的亲和力是CXCR4的十倍。SDF-1及其两种受体表达均与组织或器官所处状态有关，当处于低氧或缺血状态时，它们的表达量会明显上升，如心脏缺血时，SDF-1表达会立刻上升，7 d内逐渐下降。因此在利用SDF-1治疗时，要把握这个时间窗[17-18]。

1.2 SDF-1与其受体的相互作用

基于SDF-1三维结构的分析，目前，SDF-1和CXCR4相互作用的机制被人们普遍接受的是双位点模型(two-site model)，即CXCR4 N端首先与SDF-1 N端RFFESH模体结构(第12-17氨基酸残基)结合，启动SDF-1和CXCR4构象的变化；SDF-l的N端处于无序状态的第1-11位氨基酸(K-P-V-S-L-S-Y-R-CPC-)形成特定构象，并与CXCR4螺旋区的凹槽结合，从而诱导CXCR4跨膜螺旋区的构象变化，随即启动G蛋白偶联的信号转导过程，激活细胞内一系列信号转导通路，引起MSCs的趋化运动[19-20]。目前对于CXCR7的作用尚不完全清楚，有研究[21-22]证明CXCR7的活化不能引起Ca2+流动或细胞迁移，更多是与MSCs的存活及黏附有关,但CXCR4和CXCR7均与MSCs的旁分泌行为有关。也有学者[23-24]发现MSCs的迁移与CXCR4和CXCR7都有关，即两种受体之间可能具有协同作用，但其增殖却只与CXCR7有关。此外，CXCR7也可能与CXCR4形成异二聚体，作为一种非信号的诱导受体而存在，进而调控CXCR4与CXCL12的信号通路[25]。

1.3 SDF-1对BMSCs的趋化作用

BMSCs归巢是一个非常复杂的过程，随着研究深入，人们发现SDF-1在BMSCs的归巢、维持、发展等行为中起着关键性作用，来源于骨髓、脐带血中的CD34+造血干/祖细胞表面表达其受体CXCR4，SDF-1与CXCR4结合后可以产生定向迁移作用。研究[26-28]已经证实，当组织或器官损伤后，SDF-1表达量明显增加，损伤部位会出现大量MSCs，在使用CXCR4拮抗剂AMD3100或CXCR4抗体后，损伤部位MSCs则明显减少，Yang等[29]在体外利用SDF-1和CXCR4的相互作用及转染技术建立CXCR4在BMSCs表面过表达，发现过表达SDF-1明显加强了BMSCs向受损部位迁移，证实SDF-1对MSCs具有趋化作用。SDF-1对BMSCs的定向迁移作用在一定范围内与SDF-1浓度呈正相关，研究发现[25,30]当SDF-1浓度在100 ng/mL以下时，MSCs迁移量逐渐增多，超过100 ng/mL时，迁移量逐渐减少，并且使用CXCR4特异性抑制剂AMD3100后，迁移量减少得更加明显。另外，提高外周血中SDF-1表达或降低骨髓内SDF-1表达，提高BMSCs表面CXCR4表达，形成骨髓内外SDF-1浓度差，也可促进BMSCs归巢[3-32]。BMSCs运动到靶器官后，SDF-1可激活靶器官细胞表面上的黏附分子，如淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function-associated antigen 1，LFA-1)及晚期活化抗原-5(very late activation antigen-5，VLA-5)等，促进细胞黏附到血管内皮上，进而穿过血管壁，进入靶器官并发挥作用[33]。

2 SDF-1/CXCR4轴促进BMSCs迁移的机制

SDF-1与其受体CXCR4对BMSCs的迁移作用机制尚不完全清楚，研究表明SDF-1/CXCR4轴趋化作用涉及的信号通路主要有磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases/extracellular regulated protein kinases，MAPK/ERK)、应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase，SAPK/JNK)及Wnt信号通路(wingless-related MMTV integration site，wnt)四种。

2.1 SDF-1和Wnt信号通路

Wnt属于糖基化蛋白家族的分泌性蛋白，分子量一般在0～40 kDa，富含半胱氨酸，目前在人及小鼠等哺乳动物中发现的Wnt至少有19种。Wnt信号通路分为经典和非经典通路，目前研究较多的是经典途径。经典通路即Wnt蛋白与靶细胞表面的受体Frizzled或LRP复合物结合，直接作用于Dsh和Axin，进而抑制由GSK-3/APC/Axin组成的复合物导致的β-catenin的降解和磷酸化，使其在细胞质和细胞核积聚，核内的β-catenin在与转录因子LEF或TCF结合，进而影响目标基因的转录[34-35](见图1)。非经典通路不依赖β-catenin，而是依靠PKC、PLC及JNK等蛋白发挥作用，包括WNT/Ca2+和Wnt/PCP(planner cell polarity pathway)两种途径[36-37]。

图1 Wnt经典信号通路Fig.1 Classical Wnt signal transduction pathway (from Nature Reviews Genetics, 2004, 5(9):692)

大量研究表明，Wnt经典通路对BMSCs的迁移、增殖及成骨具有重要作用。目前已知Wnt3a和Wnt6均可激活经典Wnt信号通路，促进BMSCs迁移，并且Wnt3a的促进作用呈剂量依赖性[38-39]。此外，研究[40-41]发现，Wnt5a可激活非经典信号通路下游信号ROR2包括JNK和PKC，进而促进BMSCs迁移。Wnt通路对细胞的迁移作用可能被SDF-1/CXCR4信号轴调节，研究[42-43]发现，当阻断CXCR4表达时，Wnt/β-catenin经典通路TCF的目标基因如MMP-9等表达明显被抑制，细胞迁移也明显被抑制。此外，Wnt3a可通过激活经典信号通路，使β-catenin在细胞核内蓄积，与转录因子LEF1/TCF结合形成复合物，并与CXCL12基因启动子相互作用，下调SDF-1/CXCL12表达，抑制BMSCs迁移[44]。

2.2 SDF-1和PI3K/AKT通路

PI3K是由相对分子质量110×103的催化亚基(p110)和相对分子量85×103的调节亚基(p85)组成的异源二聚体，p110主要产生PIP3，而p85主要负责PI3K与其上游影响因子之间的相互作用。PI3K依据结构特征和作用脂质底物的不同在哺乳动物中主要分为3型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。具有脂类激酶(磷脂酰肌醇激酶)和蛋白激酶(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)的双重活性，能特异性催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶，募集和激活下游的靶物质而启动一系列信号级联反应。Akt又称PKB，是PI3K下游的一个重要靶激酶，约由480个氨基酸组成，目前已知Akt有三种类型，即Akt1、Akt2和Akt3。分别受三种不同的基因编码调节，有80%的氨基酸序列同源，有研究发现[45-47]，Akt1主要促进细胞的增殖和抗凋亡作用，Akt2主要控制细胞迁移和基质特征有关。PI3K/Akt通路组成如图2，当跨膜蛋白偶联受体(GPCRs)或RAS等激活I型PI3K后，活化的PI3K可使质膜上4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1,4,5三磷酸肌醇(PIP3)，PIP3作为第二信使结合Akt得PH结构域，使其转移到细胞膜上，定位于磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)附近，而PDK1可磷酸化Thr308位点，从而活化Akt，并激活一系列下游信号分子。另外，雷帕霉素复合物2(mTORC2)可磷酸化Ser473位点，从而活化Akt。PI3K/Akt是一条经典信号通路，与细胞存活、分化、生长、迁移及凋亡等有关[48]。PI3K/Akt可促进基质金属蛋白酶(MMP)表达，进而降解细胞外基质和基底膜，促进BMSCs迁移[49]。另外，辛伐他汀可提高CXCR4在BMSCs表面及细胞内部表达，并且可增强PI3K/AKT通路活化，活化的PI3K/AKT抑制MiR-9表达，增强SDF-1/CXCR4介导的BMSCs迁移作用[50]。研究[51-53]发现，SDF-1预处理BMSCs后，可明显促进CXCR4过表达及BMSCs迁移，且用LY294002(PI3K抑制剂)能明显阻断BMSCs迁移，因此推断SDF-1/CXCR4轴可能激活了PI3K/Akt通路而促进BMSCs迁移。

图2 PI3K/Akt信号通路Fig.2 AKT as an example of a PI3K effector (from Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2012, 13(3):200)

2.3 SDF-1和MAPK信号通路

MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于绝大多数细胞内，在细胞内具有生物进化的高度保守性，可将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内。MAPK经典通路一般由三级级联反应组成，各种细胞因子、G蛋白偶联受体等激活一级激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)，然后其激活和磷酸化中间激酶(MAPKK)，MAPKK在激活和磷酸化三级激酶MAPK，MAPK是主要的效应分子[54]。目前，在哺乳动物中已经确定的MAPK家族成员有五组：ERK1/2、JNKs(c-jun amino-terminal kinases，JNKs)、p38、ERK3/4及ERK5，目前研究最详细的是ERK1/2、JNKs及p38激酶，MAPK对调节细胞的增殖、分化、凋亡及迁移有重要作用，这几种MAPK通路激活机制如图3[55]。

图3 MAPK通路激活机制Fig.3 Signaling cascades leading to activation of the MKs (from Microbiol Mol Biol Rev, 2004, 68(2):321)

ERK与MAPK具有共同的结构和生化特征，属于MAPK家族，与ERK相关的MAPK信号转导通路被认为是经典通路。受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体及部分细胞因子受体均可激活ERK信号转导通路，ERK被激活后，可转移至细胞核内，磷酸化c-jun、E-20-6原癌基因蛋白1等的转录因子。研究[56]证实，ERK1/2即p44MAPK/p42MAPK可提高肌球蛋白轻链激酶(myosin light-chain kinase，MLCK)活性，增加MLC磷酸化及促进细胞迁移，也可磷酸化细胞质内细胞骨架成分微管相关蛋白1(Micro-tubule-associated protein，MAP)及MAP2，重塑细胞骨架，促进细胞迁移。研究表明MAPK/ERK的迁移作用与SDF-1/CXCR4有关，Cui等[57]发现当给予CXCR4抑制剂AMD3100或抗CXCR4后，ERK磷酸化水平明显降低，细胞迁移明显受抑制，因此推测SDF-1/CXCR4轴通过激活MAPK/ERK通路，促进细胞迁移。也有学者[58]指出，重组SDF-1可作为上游信号分子激活其下游信号分子—转录激活因子3(activator of transcription 3，STAT3)及MAPK/ERK，促进BMSCs体外迁移。

2.4 SDF-1和JNK/SAPK通路

JNK也属于MAPK家族，也是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，又被称为SAPK，含有双重磷酸化模体结构Thr-Pro-Tyr。目前已知，JNK蛋白激酶可被三种基因编码，JNK1和JNK2基因在体内广泛表达，而JNK3的基因主要在脑、心脏中表达。研究表明[59-60]，JNK可被细胞膜上其上游信号分子MKK4、MKK7等激酶激活，而且是通过对其酪氨酸和苏氨酸活化环的Thr-Pro-Tyr模体结构双重磷酸化实现的(如图4)，JNK/SAPK在将信号转移到细胞内与底物c-jun、Elk-1等结合形成二聚体，提高转录因子活性，调节细胞功能，如增殖、存活、凋亡及迁移。

图4 JNK激活机制Fig.4 Stress-activated MAPK signaling modules (from Cell, 2000, 103(2):240)

研究证实JNK/SAPK对促进细胞迁移具有重要作用，Kawabata等[61]研究显示，EGF(epidermal growth factor，EGF)可促进成骨细胞迁移，并且在10 ng/mL的浓度下迁移作用最明显，并且给予EGF刺激后，JNK/SAPK的磷酸化明显增强，当给予resveratrol干预后，EGF的迁移迁移作用明显被抑制，JNK/SAPK的磷酸化也明显减弱，说明EGF通过激活JNK/SAPK通路促进成骨细胞的迁移。Zhang等[62]在研究中也证实Actin B通过激活JNK/SAPK通路促进BMSCs迁移。

Yuan等[63]发现，低水平剪切应力可促进BMSCs迁移，并且提高SDF-1和CXCR4表达及促进JNK/SAPK和p38MAPK磷酸化，使用CXCR4特异性抑制剂AMD3100后，BMSCs的迁移明显被抑制，JNK、p38的磷酸化也明显减弱，进一步说明了JNK/SAPK参与BMSCs迁移过程。Pi等[64]研究发现，JNK3可作为eNOS的下游信号分子，SDF-1预处理内皮细胞后，激活eNOS产生NO，磷酸化JNK3，而不是JNK1/2，进而促进内皮细胞迁移。

2.5 SDF-1通过其他机制促进BMSCs迁移

SDF-1还可通过其他机制促进干细胞迁移，Li等[65]在实验中利用SiRNA转染技术抑制CXCR4的表达，然后给予SDF-1以刺激牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)，发现抑制了FAK、PI3K、Akt、GSK3β和β-catenin磷酸化，并且抑制了hDPSCs迁移，这表明FAK、PI3K、Akt、GSK3β和β-catenin作为CXCR4的下游信号分子参与SDF-1诱导的hDPSCs迁移过程。Ye等[66]发现CXCR4作为低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)的靶基因，在HIF-1修饰BMSCs后CXCR4表达会被上调，并且增强了BMSCs的迁移。此外，其他细胞因子如FMS样酪氨酸激酶3(Flt-3)、干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、造血生长因子(HGF)、转化生长因子-β(TGF-β)血管内皮生长因子(VEGF)及胰岛素样生长因子(IGF-1)修饰MSCs也可上调SDF-1及CXCR4的表达，进而促进MSCs迁移[67-68]。