奇异变形杆菌毒力因子的研究进展

陈小敏， 杨 华， 桂国弘， 温雪婷， 戴宝玲 ， 肖英平*

(1.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058；2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省植物有害生物防控省部共建国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310021)

奇异变形杆菌(Proteusmirabilis，PM)是革兰阴性细菌，属于肠杆菌科，群集运动是奇异变形杆菌的特殊运动形式，该菌最初由Hauser在1885年发现，并以希腊神明的名字为其命名，意为可以任意变化形状来避免被质疑[1]。奇异变形杆菌在自然界中广泛存在，可在土壤、污水中检测到，也可寄生在人和动物的肠道，与临床关系密切，常出现在人类和动物的机会性感染中。尿路感染(UTI)是严重的公共卫生问题，在全球范围内造成了巨大的经济负担。2007年，仅在美国，UTI有1 050万次问诊量(占所有门诊访问的0.9%)，2万～3万急诊部门访问，这种感染的社会成本，包括医疗费用和工作时间，每年约为35亿美元[2]。奇异变形杆菌是引起UTI的原因之一，通常与尿路梗阻、导尿管阻塞、膀胱和肾结石形成以及菌尿有关，并且奇异变形杆菌是引起复杂尿路感染(CAUTI)的主要原因，最终导致败血症或全身炎症反应综合征(SIRS)，是死亡率在20%～50%的严重疾病[3]。奇异变形杆菌致病机理复杂，通过导尿管到达膀胱后可在0.5 h 后黏附并侵入膀胱上皮细胞，24 h后在聚集部位引起毒素释放、局部氨(NH3)的浓度增加、大量嗜中性粒细胞浸润，组合效应导致结晶矿物沉积和尿路上皮表面的破坏[4]，其主要毒力因子包括菌毛、尿素酶、溶血素、金属摄取和免疫逃避等。

1 菌 毛

引起CAUTE的第一步是进入尿道，尽管导管提供了直接通向膀胱的路径，但是奇异变形杆菌需要紧紧地黏附在导管上以抵抗尿液的流动，并横穿流动的尿液或破坏尿液的流动进入膀胱。奇异变形杆菌易定殖在导管的内腔和外表面，与菌毛对尿路上皮的附着以及形成生物膜有关。

全基因组测序结果显示奇异变形杆菌有17种可能的菌毛，其中，耐甘露糖样变形杆菌菌毛(MRP)、尿路上皮细胞黏附菌毛(UCA)、室温菌毛(ATF)、奇异变形杆菌菌毛(PMF)对UTI作用的研究较为广泛。Paola等[5]的实验结果表明MPR、UCA、ATF、PMF均有助于形成稳定的生物膜。首先，其菌毛突变体在导尿管中的迁移能力都显著降低，其次，与野生型相比，MRP和ATF菌毛突变体形成较小的生物膜，UCA和PMF菌毛突变体形成了较大的生物膜，显示出菌毛各自不同的生物结构特征。UCA菌毛突变体与野生型菌株相比，对脱落的尿路皮细胞的黏附力明显降低，该结果支持UCA可能在与泌尿系统上尿道粘连中起重要作用，并可能在肾脏定殖中发挥作用[6]。

MRP被认为是研究奇异变形杆菌菌毛的最佳对象，是参与黏附、遗传毒性和细胞毒性的重要毒力因子[7]。分别在奇异变形杆菌感染后的1、3、7 d收集尿液，提取尿液中的细菌RNA进行基因芯片和qRT-PCR分析发现，编码MRP的基因是上调倍数最高的基因，其中MRP的主要结构基因mrpA上调了13 800倍[8]。耐甘露糖样变形杆菌菌毛(MRP)操纵子由MrpI、含可逆元件(IE)的基因间区域和mrpABCDEFGHJ基因簇组成，MRP操纵子中的最后一个基因mrpJ可能在奇异变形杆菌的毒力中起着全局调控的作用。报道显示mrpJ在临床分离物中普遍保守[9]，小鼠尿道感染模型中mrpJ缺失突变体在膀胱中定殖水平明显降低，基因芯片分析发现UTI期间mrpJ的模拟控制表达引起217个与细菌毒力、VI型分泌系统和新陈代谢基因的表达差异[10]，mrpJ调控几种已知和预测的毒力因子的证据，包括其自身的MRP操纵子、群集细胞分化因子、Pta毒素、ZapA蛋白酶和VI型分泌系统(T6SS)[11]。

2 脲 酶

奇异变形杆菌很少形成膀胱细胞内群落，它在膀胱腔中建立了大规模的脲酶和MRP菌毛依赖的细胞外集群，引起强烈的嗜中性粒细胞反应，与尿路上皮破坏等相关。通过比较奇异变形杆菌野生型和突变体的定殖，确定了脲酶和MRP为群集发育所需的两个重要毒力因子[12]。与单一细菌感染的小鼠相比发现，两种细菌共感染的小鼠表现出更高的尿液pH值、尿石症、菌血症以及更显著的组织损伤和炎症，而脲酶活性的增强是促使组织损伤和共感染期间两种细菌向血流传播的主要因素[13]。

图1 奇异变形杆菌HI4320中ure基因簇及蛋白产物Fig.1 Ure genes clusters and its protein products in Proteus mirabilis HI4320

脲酶是Ni2+依赖性金属酶，在植物、真菌和细菌中均存在，根据来源不同，脲酶的结构组成有所不同，细菌中的脲酶(除了幽门螺杆菌脲酶)通常由3个不同的亚基组成，连接在一起形成三聚体，激活其脲酶载脂蛋白并组装其金属中心，至少需要3种辅助蛋白质：UreD、UreF和UreG[14]。奇异变形杆菌的脲酶基因簇由ureRDABCEFG组成，结构亚基γ、β和α分别由ureA、ureB和ureC编码[15]。脲酶对奇异变形杆菌的致病性十分重要，其催化尿素水解成二氧化碳和氨，导致局部pH升高，随后形成磷酸铵镁(鸟粪石)和钙磷酸盐(磷灰石)沉淀，此过程的结果以导管中生物膜的形成和肾结石的积累为特征，引起输尿管阻塞、对宿主细胞的氨毒性和直接的组织损伤。这种晶体聚集产生结石使感染复杂化有三个原因：首先，结石间隙内的奇异变形杆菌难以用抗生素清除；第二，结石作为非奇异变形杆菌细菌的病灶发生UTI；第三，结石可以阻止尿流，尿液排泄不畅和回流到肾脏可能导致严重的并发症，包括肾盂肾炎、败血病、休克等。

3 金属摄取

在UTI期间，宿主和细菌争夺对基本金属的获取，细菌赢得竞争将有利于UTI的建立。研究表明细菌摄取Fe3+、Zn2+和Ni2+，并输出Cu+，对于在泌尿系统的成功定殖至关重要[16]。

铁作为一种重要元素，对于不同生物过程的许多蛋白质和酶的功能而言是必需的。细菌必须使用专门的系统从宿主中获取铁，最初，人们认为奇异变形杆菌缺乏铁载体的能力，奇异变形杆菌HI4320的基因组注释和铁限制条件下的基因芯片分析推测奇异变形杆菌中至少有21个铁摄取系统，其中的2个已被证明具有与铁载体生物合成和ABC转运相关的基因[8，17]。其中一种是先前未在任何细菌中被描述过的非核糖体肽合成酶(NRPS)-非依赖性铁载体(NIS)系统，现被称为变形杆菌素(由操纵子pbtABCDEFGHI编码)[17]。另一种含nrp操纵子，已显示nrp操纵子在奇异变形杆菌 HI4320 的高致病岛(HPI)内编码，其与耶尔森氏菌的HPI具有同源性[18]。

锌是另一种对许多蛋白质和酶的功能至关重要的金属，奇异变形杆菌具有锌限制条件下生长所需的功能性锌摄取系统(ZnuABC)，Greta[19]等的研究首次表明，在实验性尿路感染的小鼠模型中，摄取锌的能力有助于感染期间奇异变形杆菌的适应，为其提供了竞争优势。ZnuC在奇异变形杆菌的锌摄取中发挥作用，其存在使得奇异变形杆菌在锌限制条件下生长至更高的密度，并在基本培养基中生长时产生竞争优势；锌的吸收有助于奇异变形杆菌的运动，ZnuC基因拷贝中断的菌株运动能力显著降低并产生更少的鞭毛蛋白。

镍是多种酶(包括脲酶)的重要辅助因子，Ni2+对于脲酶的催化是不可或缺的。然而，编码镍ABC转运蛋白(PMI2943-PMI2947)的基因都不是奇异变形杆菌的重要适应因子。清除和摄取金属的能力是许多病原体的关键特征，但金属外排转换也是避免自身毒性的重要方面[16]，因为细胞内高浓度的过渡金属是有毒的，它们会干扰细胞的氧化还原电位并产生高反应性的羟基自由基。通过在基本培养基中加入硫酸镍干扰奇异变形杆菌生长的研究发现，与野生型相比，PMI1518(推测编码高亲和力的镍输出蛋白)突变菌株对镍更敏感，具体表现为在培养基中添加0.625 mmol/L硫酸镍时生长速度显著变慢，在5 mmol/L硫酸镍条件下生长被完全抑制，证明PMI1518编码有助于镍耐受性的镍外排体，PMI1518编码的高亲和力镍输出蛋白是肾定殖的重要适应因子[20]。

在细菌中，铜被用作催化一些参与电子转移反应的金属酶，如细胞色素氧化酶，同时，也是铜解毒酶的辅因子[21-22]。铜中毒对细菌细胞有毒害作用，因此，细胞内铜的水平必须得到很好的控制。奇异变形杆菌ScsC (PmScsC)是一种独特而高度动态的二硫键异构酶，N-末端残基将3个催化结构域一起带入三聚体中，并且独特的柔性连接体使得能够进行非凡的扭转和延伸运动来影响催化结构域，研究表明，PmScsC三聚作用及其活性位点半胱氨酸，是铜的存在下野生型奇异变形杆菌群集活性所必需的，这种蜂拥现象有助于铜中毒的防御[23]。

4 细菌毒素

溶血素(HpmA)和变形杆菌毒性凝集素(Pta)对于组织破坏和细菌传播至肾脏是重要的[24]。HpmA是一种具有溶血活性的胞外蛋白，通过将其自身插入细胞膜使宿主细胞不稳定引起穿孔，导致组织损伤、剥脱和营养物释放。Pta是一种具有丝氨酸蛋白酶活性的自主转运蛋白，可刺穿宿主细胞膜，引起细胞溶质外流、渗透压改变和丝状体解聚，损害细胞的结构完整性，导致膀胱和肾脏损伤。

毒素作为毒力因子的角色并没有被完全解释清楚。在单一因子的CAUTI(复杂尿路感染)中，溶血素未被认为是重要的适应因子，可能是因为CAUTI感染模型中导管引起的炎症和组织损伤水平较高，不需要大量毒素的贡献。通过对奇异变形杆菌毒力基因产物的调查，人们认为HpmA可能是NLRP3炎性小体活化和产生IL-1 β的必需条件[25]。研究一系列羧基末端赖氨酸突变体发现，HpmA溶血活性的丧失与羧基末端氨基酸Leu263被替代相关[26]。

5 免疫逃避

宿主与病原体之间进行着持续不断的斗争，宿主内寄生的细菌必须逃避体内的先天性和适应性免疫应答才能获得生存机会，在与各自宿主进行共同进化的过程中，微生物已经制定了一些规避宿主固有和适应性免疫因子的策略。

奇异变形杆菌有多种免疫逃避机制。第一，这种微生物可表达多种菌毛和鞭毛，从而欺骗免疫系统。细菌鞭毛是一种非常复杂的分子机器，在发病中具有多种作用[27-28]，包括达到最佳宿主位置、定殖或入侵、在感染部位维持以及感染后扩散。一旦到达目标位置，鞭毛可协助黏附到表面，分化成生物膜、分泌效应分子并进一步穿透组织结构或激活吞噬作用进入真核细胞，在感染发生后，鞭毛通过改变基因表达或进行结构修饰来躲避宿主的免疫防御。鞭毛蛋白是鞭毛的结构组分，奇异变形杆菌鞭毛蛋白具有在T24膀胱细胞和经鞭毛蛋白尿道滴注后的小鼠膀胱中诱导促炎因子表达的能力，此外，鞭毛蛋白引发炎症，促使白细胞募集到膀胱上皮细胞[29]。第二，奇异变形杆菌编码金属蛋白酶(ZaPA)，裂解血清中的免疫球蛋白IgA1、IgA2和IgG，为躲避黏膜免疫提供保护。第三，生物膜的形成可防止细菌被洗刷出去，相比浮游菌能耐受更高剂量的抗生素[30]，为奇异变形杆菌提供了一个躲避免疫系统追踪和抗菌治疗的避难所，被认为是持续感染和炎症的最终原因[31]。

6 其他因素

除了上述常见毒力因子外，人们也发现了一些与致病性相关的其他因素。多磷酸激酶(PPK)由ppk基因编码，Liang等[32]研究表明PPK是重要的调节因子，ppk突变菌株缺乏对尿路上皮细胞的黏附和侵袭能力，并影响奇异变形杆菌的群集运动能力和生物膜形成能力，在致病性奇异变形杆菌的毒力中扮演重要角色。Hfq是一种RNA分子伴侣，影响许多与奇异变形杆菌毒力相关的表型，包括运动性、生物膜形成和对压力如高渗透压的抗性[33]。环AMP受体蛋白(Crp)是细菌中的主要转录调节因子，Tsai等[34]的研究证明，Crp影响奇异变形杆菌的包括运动性、菌毛介导的黏附性、对葡萄糖的耐逆性等毒力相关的表型。

7 展 望

认识和理解引起感染的细菌的毒力因子，可为这些临床问题的诊断和治疗的解决方案提供基础，阐明奇异变形杆菌感染过程以及与宿主间的相互作用，是理解和预防奇异变形杆菌感染的关键。虽然现有的研究已经确认奇异变形杆菌可以引起尿路感染并产生尿路结石，新型研究方法的使用也为深层次了解奇异变形杆菌的分子特征提供了帮助，但关于奇异变形杆菌究竟如何引起疾病发生仍有疑问。为了进一步探索其致病机制，可能还需要进一步分析导尿管、膀胱和肾脏感染之间的有机联系，确定各毒力因子在感染各阶段的生活方式。