番木瓜籽挥发油对变异链球菌的抑制作用研究

姚孟霞，张菁芸，陈锦萍，何小稳，易国辉

（海南医学院科学实验中心，海南海口571199）

龋病是一种常见的多发性因素联合作用的口腔疾病。多年研究证明，变异链球菌（Streptococcus mutans）是导致人类患龋的主要病原菌，它的致龋毒力主要表现在牙面黏附、聚集并形成牙菌斑生物被膜[1]。研究发现，具有生物被膜的细菌抵抗抗生素的作用力要比游离态的细菌高1 000倍以上，并且难以用普通的消毒方法将其除掉，因此控制牙菌斑生物被膜的形成是预防和控制龋病的关键[2]。变异链球菌毒力基因luxS、gtfB、gbpD、brpA和ftf在其聚集、黏附形成牙菌斑生物被膜的过程中发挥重要的作用，已有研究证明抑制毒力基因的表达即可控制生物被膜的形成[3-9]。

植物挥发油又称精油，具有抗氧化、抗病毒、抗菌等多种生物活性[10-12]。番木瓜为被广泛食用的药食同源食品，近年发现，在番木瓜籽中提取出的精油检测到芳香烷侧链异硫氰酸盐，主要成分为异硫氰酸苄酯（benzyl isothiocyanate，BITC），含量高达 99.36%[6，10，13-14]。异硫氰酸苄酯是十字花科蔬菜（如辣根、芥末、甘蓝、花椰菜、卷心菜和水芹菜等）中的硫代葡萄糖苷的降解产物，以往研究表明异硫氰酸苄酯具有极高的生物活性，例如杀菌、抗氧化、抑制血小板聚集、防癌和抑癌等作用[7-8，11，15-17]，但未发现其在抑制口腔细菌生长方面的研究报道。本试验拟建立体外变异链球菌生物被膜模型，检测番木瓜籽挥发油对其抑制效果，并在此基础上利用实时定量PCR（real-timequantitativePCR，qPCR）技术检测变异链球菌致龋毒力基因luxS、gtfB、gbpD、brpA和ftf表达水平的变化，以揭示番木瓜籽挥发油对变异链球菌生物被膜的抑制作用是否是通过调节某些毒力基因的表达而实现，为临床筛选防龋药物开辟一个新方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ATCC700610变异链球菌UA159：上海瑞楚生物科技有限公司；番木瓜籽挥发油：海南医学院科学实验中心提供；氯已定、吐温80：上海麦克林生化科技有限公司；甲基四氮盐（the abated tetrazolium salt，XTT）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；脑心浸液培养基（brain heart infusion，BHI）：青岛海博生物科技有限公司；Total RNA提取试剂盒：宝日医生物技术（北京）有限公司；实时荧光定量PCR预混液、反转录试剂盒：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；引物：上海生工生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

荧光定量PCR仪（Mx3005P）：安捷伦科技（中国）有限公司；多功能酶标仪（Synergy HTX）：美国伯腾仪器有限公司；微孔板培养箱（SI19）、离心机（5424R）、生物安全柜（HR60-IIIA2）、厌氧培养箱（YQX-II）、细菌浊度仪（WGZ-2XJ）：海南隽誉科技有限公司；气相色谱-质谱联用仪（QP2010plus）：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 世纪菌悬液制备

变异链球菌菌株冻干粉在厌氧培养箱中37℃常规复苏培养至第二代，革兰氏染色镜检确认菌落生长形态无污染后挑取单个纯菌落接种于BHI培养基中，37℃厌氧培养24 h，按照美国临床实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，CCLS）标准方法，使用细菌浊度仪测定菌悬液麦氏浓度，用稀释液将菌悬液浓度校正至1麦氏浓度（3×108CFU/mL）备用。

1.3.2 药液配制

番木瓜籽挥发油为海南医学院科学实验中心提取，并经气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析其BITC含量在99%以上，纯油用2%的吐温80溶液溶解，后用无菌水配制成10 mg/mL的母液置于4℃保存；工作液用BHI液体培养基将挥发油母液稀释成1 280 μg/mL；对照药物氯已定（chlorhexidine，CHX）用BHI液体培养基稀释成32 mg/mL。

1.3.3 试验分组

空白对照组：BHI液体培养基；试验组（番木瓜籽挥发油和CHX）：含药液和菌液的BHI液体培养基；阴性对照组：含菌液的BHI液体培养基。

1.3.4 最低抑制生物被膜形成浓度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）测定

试验浓度每组4个重复，在96孔细胞培养板试验孔中（1号～7号）加入 100 μL的 BHI培养液，向2号A～D孔加入100 μL番木瓜籽挥发油工作液（浓度为1 280 μg/mL）和 E～H 加入 100 μL 氯已定工作液（浓度为32 mg/mL），然后依次进行倍比稀释（每孔挥发油浓度为：320、160、80、40 μg/mL 和 20 μg/mL；氯已定浓度为：8、4、2、1 mg/mL 和 0.5 mg/mL），1 号孔做为空白对照组，继续加入100 μL BHI培养液，其它孔各加入100 μL 1× 106CFU/mL 的 S.mutans菌液，7号孔为阴性。96孔板加盖用薄膜密封以减少孵育过程水分的蒸发，置于CO2厌氧培养箱37℃孵育48 h，小心去除培养液，用无菌磷酸盐缓冲液洗板3次后，每孔加入现配的XTT液100 μL，避光培养2 h，然后酶标仪A490nm读数。抑制率/%=（阴性组A值-试验组A值）/（阴性组A值-空白组A值）×100。MBIC90为能够抑制90%以上生物被膜形成的最低药物浓度。

1.3.5 qPCR检测变异链球菌毒力基因 luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf的表达情况

1.3.5.1 总RNA的提取

选取番木瓜籽挥发油浓度为40、80 μg/mL、氯已定浓度2 mg/mL、空白药物作为分组，于6孔细胞培养板中培养48 h，小心去除培养液，用无菌磷酸盐缓冲液洗板3次后，用细胞铲收集生物被膜态的S.mutans于2 mL离心管中，在各离心管中加入500 μL浓度为35 mg/mL的溶解酶并充分吹打混匀后置于37℃水浴锅中孵育4 h，之后所有操作均在室温中进行。按照细菌总RNA提取试剂盒说明书RNAisoTMPlus（Total RNA提取试剂）进行总RNA提取。

1.3.5.2 逆转录

确保总RNA质量符合后续试验要求后，按反转录试剂盒说明书逐步进行，在冰上进行反转录混合液配置。所使用的枪头及PCR管均为RNA酶处理过的一次性耗材。

1.3.5.3 qPCR

NCBI Primer-BLAST设计最优引物，见表1。遵照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix试剂盒说明书配制qPCR反应液，反应液配制过程需在冰上操作，应用安捷伦Mx3005P定量仪进行qPCR反应。

1.3.6 数据处理

2-△△Ct法处理荧光定量数据，SPSS 17.0统计软件和Excel软件进行数据分析，两组间均数比较用t检验，p＜0.05有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 番木瓜籽挥发油对变异链球菌生物被膜形成的影响

XTT法测得番木瓜籽挥发油和CHX对变异链球菌生物被膜形成的吸光度值结果如图1、图2所示。

随着番木瓜籽挥发油与CHX浓度的增加，A值减小，表明对变异链球菌生物被膜形成的抑制增强，而当药物浓度达到一个临界值时，A值显著减小，其抑制率也显著增强。番木瓜籽挥发油和CHX对变异链球菌生物被膜形成的抑制率的计算结果见表2。通过对抑制率的计算可知阳性对照药物CHX对变异链球菌的MBIC90为2 mg/mL，其抑制率达到96.3%，与文献报道相符[9，18]，番木瓜籽挥发油对变异链球菌的MBIC90为80 μg/mL，其抑制率达到95.4%。

图1 XTT法测得番木瓜籽挥发油对变异链球菌生物被膜形成的吸光度值Fig.1 The absorbance of Carica papaya Linn.seed essential oil on Streptococcus mutans biofilm by XTT

图2 XTT法测得CHX对变异链球菌生物被膜形成的吸光度值Fig.2 The absorbance of CHX on Streptococcus mutans biofilm by XTT

表2 番木瓜籽挥发油和CHX对变异链球菌生物被膜形成的抑制率Table 2 The inhibition rate of Carica papaya Linn.seed essential oil and CHX on Streptococcus mutans biofilm

2.2 番木瓜籽挥发油对变异链球菌毒力基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf表达水平的影响

总 RNA OD260/OD280的值范围在 1.8～2.2之间，RNA 浓度在 190 ng/μL～460 ng/μL 之间，质量稳定，完整无降解符合后续试验要求。根据番木瓜籽挥发油和CHX对变异链球菌的MBIC结果，选取番木瓜籽挥发油40、80 μg/mL和CHX 2 mg/mL 3个药物浓度作用变异链球菌，检测其对变异链球菌生物被膜形成过程中毒力基因 luxS，gtfB，gbpD，brpA 和 ftf的表达水平，结果如图3所示。

图3 S.mutans相关毒力基因的表达水平Fig.3 Expression levels of S.mutans related virulence genes

番木瓜籽挥发油40 μg/mL和80 μg/mL和阳性药物CHX 2 mg/mL作用变异链球菌后，各毒力基因表达水平与阴性处理组相比显著性下调（p＜0.01），在番木瓜籽挥发油40 μg/mL和80 μg/mL浓度作用下，基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf的表达水平随浓度增加呈现显著性下调（p＜0.01）。番木瓜籽挥发油80 μg/mL和阳性药物CHX 2 mg/mL对其毒力基因的表达水平无显著性差异，效果相当，与MBIC结果一致。

3 结论

本试验研究了番木瓜籽挥发油对变异链球菌生物被膜形成的影响，并进一步对变异链球菌致龋相关的5种主要毒力基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf在转录表达水平上做了相关研究。研究表明番木瓜籽挥发油对变异链球菌生物被膜的形成有较为显著的抑制作用，浓度为80 μg/mL时的抑制率达95.4%。在毒力基因表达水平研究中选取番木瓜籽挥发油40、80 μg/mL和CHX 2 mg/mL3个药物浓度作用变异链球菌，发现与不加药物的阴性对照相比，5种毒力基因luxS，gtfB，gbpD，brpA和ftf的转录表达均受到了显著抑制，当番木瓜籽挥发油浓度80 μg/mL时，毒力基因受抑制的表达水平与阳性药物CHX 2 mg/mL的效果相当。由此可推断番木瓜籽挥发油是通过抑制相关毒力基因的表达来影响变异链球菌生物被膜的形成，从而达到防龋的目的。因此，番木瓜籽挥发油在作为一种新型开发的防龋药物研究上具有很好的应用前景。