子宫内膜异位症患者sp1、FGF2、VEGF的表达及意义

徐 铮 刘寒梅

1.天津市红桥医院(300131)；2.昆明医科大学第五附属医院

子宫内膜异位症(EMT)是一种较常见的良性妇科病[1]。常发于育龄妇女，主要临床表现为慢性盆腔疼痛、痛经、月经不调、不孕和性交不适等[2]。EMT可发生类似恶性肿瘤的复发性、侵袭性和转移性等行为[3]。发病原因主要是子宫内膜碎片经月经逆行种植[4]。由于症状和青春期少女月经失调相似，常被误诊或推迟8～10年才被确诊，尽早诊断和治疗生物标志的发现和应用非常重要[1]。Fillppi等[5]研究发现EMT发生与血管形成有关。有研究[2，6-7]表明sp1、FGF2、VEGF水平与血管生成相关，但表达在EMT患者的临床意义尚不清楚。本研究探究EMT患者血清和组织中sp1、FGF2、VEGF的表达及临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2015年6月—2017年3月本院收治因子宫内膜异位症行腹腔手术患者60例为观察组，因输卵管性不孕行腹腔镜手术且未发现内膜异位病灶患者15例为对照组。纳入标准：①符合《子宫内膜异位症的诊治指南》[8]中EMT的诊断标准，并经腹腔镜和术后病理确诊为卵巢内膜异位症患者；②所有患者月经周期规则正常；③术前近3个月未接受任何激素或免疫抑制治疗；④患者及家属知情并自愿签署知情同意书。排除标准：①患有恶性肿瘤并发症；②患有内分泌、代谢及免疫性疾病；③ 输卵管结扎；④患有心脑肾等重要器官疾病。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 方法

腹腔镜手术前空腹取静脉血离心取上清备用。腹腔镜手术时观察组取卵巢内异位囊肿囊壁及正常子宫内膜组织0.5 cm×0.5cm，对照组取正常子宫内膜组织0.5 cm ×0.5cm，生理盐水洗净后液氮速冻5 min备用。

使用德国QiaGen公司生产试剂盒提取血清总RNA，RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa公司)提取内膜组织总RNA。检测总RNA的纯度及完整性。用反转录试剂盒(TaKaRa公司)将2 μL纯净无降解总RNA反转录为cDNA。按照TaKaRa公司SYBR Green PCR master mix试剂说明加配反应体系。每个样品设置3次生物学重复。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。体系加配完成后，放入Bio-Rad 荧光定量PCR仪进行反应，反应结束后收集数据，以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt算法计算血清和组织中sp1、FGF2、VEGF mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

内膜组织样本以10%中性福尔马林缓冲液固定后进行石蜡包埋并封片观察。随机取10个高倍镜视野进行病理切片观察并统计阳性细胞数。按照阳性细胞百分比评分：<5%为0分，5%～20%为1分，21%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；按照染色程度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，褐黄色为3分。取两组积分乘积，≤2分为阴性，>2分为阳性。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组一般资料比较

观察组60例，年龄(29.41±11.26)岁(26～37)岁。对照组15例，年龄(28.32±10.41)岁(25～37)岁。两组一般资料比较无差异(P>0.05)。

2.2 sp1、FGF2、VEGF mRNA水平比较

观察组血清sp1、FGF2、VEGF mRNA水平高于对照组(P<0.05)。sp1、FGF2、VEGFmRNA水平异位内膜>在位内膜>正常内膜(P<0.05)。见表2。

表2 血清及内膜组织中各蛋白水平比较

*与正常内膜比较#与在位内膜比较P<0.05

2.4 sp1、FGF2、VEGF蛋白阳性率比较

sp1、FGF2、VEGF蛋白主要定位于细胞核，阳性表达细胞呈棕黄色。见图1。sp1、FGF2、VEGF蛋白阳性率异位内膜>在位内膜>正常内膜(P<0.05)。见表3。

sp1蛋白正常内膜(A)在位内膜(B)异位内膜(C)；FGF2蛋白正常内膜(D)在位内膜(E)异位内膜(F)；VEGF蛋白正常内膜(G)在位内膜(H)异位内膜(I)图1 免疫组化分析各蛋白在不同内膜中表达(SP，×400)

表3 各蛋白不同内膜中阳性率比较 [例(%)]

*与正常内膜比较#与在位内膜比较P<0.05

2.5 R血清各蛋白水平对内膜异位症的诊断价值

血清sp1诊断子宫内膜异位症的ROC曲线下面积为0.846(95%CI为0.771～0.926，P<0.05)，截断值为1.42，此时敏感度为72.8%、特异度为85.9%、约登指数为0.601；血清FGF2诊断子宫内膜异位症的曲线下面积为0.831(95%CI为0.737～ 0.915，P<0.05)，截断值为1.34，此时敏感度为63.8%、特异度为97.6%、约登指数为0.623；血清VEGF诊断子宫内膜异位症的曲线下面积为0.886(95%CI为0.831～0.942，P<0.05)，截断值为1.24，此时敏感度为72.9%、特异度为82.4%、约登指数为0.596。3项联合检测的曲线下面积为0.975(95%CI为0.951～0.998，P<0.05)，敏感度为93.2%、特异度为91.1%、约登指数为0.884。

2.6 血清各蛋白水平相关性分析

子宫内膜异位症患者血清sp1FGF2表达水平呈正相关(r=0.547,P<0.05)，与VEGF表达水平呈正相关(r=0.564,P<0.05)；血清FGF2和VEGF表达水平呈正相关(r=0.547,P<0.05)。

3 讨论

EMT是一种复杂的常见妇科病，其发病机制主要有经血逆流种植学说、诱导学说、体腔上皮化生学说、遗传及免疫学说和干细胞学说等[9]。临床多认为子宫内膜异位病灶形成的生理过程主要有黏附、侵袭和血管形成三个主要步骤，MET具有肿瘤类似的生理特征[10]，同时血管形成在发病过程中也发挥着重要作用。血管形成是异位种植生长的前提，异位种植生长是在原有的毛细血管动脉端或静脉端血管丛中生长新的血管，毛细血管外基质降解，血管生成素活跃，形成血管芽胚，连通新生血管导致发病。EMT症状与青春期女性月经失调相似，易发生漏诊及误诊，寻找EMT发病过程中新的小分子标记物，并探索其在发病中的临床功能，对EMT早期诊断和治疗有重要意义。

sp1是一种重要的转录因子，位于其染色体C末端3个锌指结构能与靶基因启动子的GC结构域发生特异性结合，直接调控多数靶基因表达上调，参与细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤的形成和发展过程[11]。与肿瘤TNM分期、淋巴结转移相关[12]。於永爱等[13]研究表明sp1在上皮性卵巢癌组织中表达上调与卵巢癌的发生发展密切相关。Su等[7]研究发现，sp1在卵巢癌中高表达促进肿瘤血管生成和癌细胞侵袭。本研究中EMT患者血清sp1mRNA水平升高，在EMT异位及在位内膜组织中表达升高，与洪霞霞等研究结果一致[9]，表明sp1水平与EMT发病有关，提示检测血清和组织中sp1mRNA水平对监测EMT发病有重要意义。免疫组化结果显示sp1蛋白阳性率异位内膜>在位内膜>正常内膜(P<0.05)，表明sp1在异位及在位组织中的表达趋势与其在血清中表达趋势一致，提示检测血清sp1mRNA水平可反映sp1在组织中的表达情况。ROC分析结果显示，血清sp1 mRNA表达水平对EMT疾病诊断有一定的参考价值，但其灵敏度较低。

FGF2是一种碱性成纤维细胞生长因子，主要参与调节细胞增殖、分化、迁移等过程，能促进血管生成、胚胎发育、器官分化和伤口愈合等机体生命活动[14]。有研究[15]表明外源性FGF2可显著抑制细胞凋亡、迁移，显著提高对缺血性损伤的修复。突变FGF2基因能抑制信号传导和血管生成过程[6]，提示FGF2在血管生成过程发挥着重要作用。本研究结果表明，FGF2 mRNA水平在EMT患者血清中表达上调，与李万斌等[16]研究FGF2在子宫内膜癌中表达趋势一致，同时，EMT患者内膜组织中FGF2水平高于对照组的正常内膜组织，与FGF2在血清中的表达趋势一致，表明血清FGF2水平可代替FGF2在组织中的水平。ROC分析结果显示，检测血清中FGF2 mRNA水平可作为EMT诊断参考指标之一，但灵敏度和准确度不高。

VEGF是重要的血管生成因子，可刺激血管内皮细胞分裂增殖，诱导新血管生成[2]。有研究表明VEGF在卵巢癌中高表达，通过促进肿瘤中血管形成参与卵巢癌肿瘤细胞的浸润侵袭过程[7]。本研究结果显示VEGF在EMT患者血清和内膜组织中均表达上调，与袁源等研究结果一致[17]。VEGF水平异位内膜>在位内膜>正常内膜，表明血清中VEGF趋势与内膜异位及在位组织中一致，提示检测血清中VEGF水平可反映异位及在位内膜组织中VEGF蛋白水平，为内膜是否发生异位提供参考。ROC分析结果表明血清VEGF水平可为EMT诊断提供重要的参考，但灵敏度较低。

sp1、FGF2、VEGF各蛋白的表达趋势一致，可能参与了EMT疾病发生过程，本研究相关性分析结果显示，sp1、FGF2、VEGF两两之间呈正相关，Su等[7]研究发现sp1通过调控VEGF促进肿瘤侵袭过程；Chang等[18]研究发现FGF2通过Ras-Raf-ERK-sp1通路调控巢蛋白在C6肿瘤细胞中的表达。提示sp1可能调控FGF2和VEGF表达参与EMT疾病发生及发展过程。经ROC分析结果显示，3项联合可显著提高诊断效率，对筛查出的EMT患者重点监测，及早采取有效治疗。

综上所述，sp1、FGF2、VEGF在EMT患者血清和蛋白中均表达上调，与EMT病程进展相关，推测sp1可能通过调控FGF2和EMT表达促进EMT病程发展。以sp1、FGF2、VEGF为生物新靶点可为EMT诊断和治疗提供新思路，但具体调控机制有待进一步探究。