单甲基亚砷酸联合隐丹参酮抑制多发性骨髓瘤U266细胞增殖作用机制的研究

李 爽邹建华叶晓鸥张光霁陈 喆

多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是一种常见的血液系统浆细胞恶性肿瘤，以浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或者轻链蛋白过度增生为特征。MM常以骨痛为主要临床表现，属中医“骨痹”、“虚劳”、“骨蚀”等范畴。近年来由于MM化疗耐药，患者多数因耐药复发而死亡[1-2]。三氧化二砷（Arsenictrioxide，As2O3）为中药砒霜的有效成分，具有蚀疮、去腐、杀虫、劫痰定喘、劫疟功效。我国学者首先发现As2O3治疗急性早幼粒细胞性白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）效果显著，并阐明其主要作用机制是通过促进PML-RAR融合蛋白的降解[3-4]。研究表明，无机砷（As2O3）在体内通过肝脏甲基转移酶作用下生成单甲基亚砷酸（monomethylarsenous acid，MMAⅢ）、二甲基亚砷酸（dimethylarsenous acid，DMAⅢ）等活性代谢产物从而发挥相应的生物学效应[5-6]。丹参具有活血化瘀、凉血消痈作用，主治癥瘕积聚、疮疡肿痛，为临床抗肿瘤的常用中药。隐丹参酮（Cryptotanshinone，CPT）是丹参的有效活性成分，具有较强的抗肿瘤作用。体外研究表明，CPT能明显诱导肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞凋亡[7]。本研究观察隐丹参酮联合MMA III协同抗多发性骨髓瘤U266细胞的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料 多发性骨髓瘤U266细胞和单甲基砷酸（MMAV）由浙江大学药学院那仁满都拉教授馈赠。隐丹参酮（CPT）分子式C19H20O3，相对分子质量296.35，购置于Selleck（中国上海蓝木化工有限公司）（批次：S228502）。

1.2 细胞培养 多发性骨髓瘤U266细胞用含10%gibco胎牛血清的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖能力 常规培养多发性骨髓瘤U266细胞。按隐丹参酮单药组、MMAIII单药组、联合组分别加药处理。隐丹参酮组加入不同浓度的隐丹参酮（0、5、10、15、30、50μM）、MMAIII组加入不同浓度的单甲基亚砷酸（0、0.5、1、2、5、10μM），联合组加入浓度为15μM的隐丹参酮和1μM的单甲基亚砷酸。加入CCK-8并在培养箱中孵育后，检测吸光度值(OD值)，并计算细胞存活率。

1.4 PI/Annexin-V流式细胞术检测细胞凋亡 隐丹参酮单药组（15μM）、MMAIII单药组（1μM）和联合组分别处理细胞后，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中孵育24h。收集细胞，AnnexinⅤ-FITC和PI染料处理并孵育后流式细胞仪FITC-PI模式下检测细胞凋亡率。

1.5 Western Blot检测PARP凋亡蛋白 研究共分为隐丹参酮单药组（15μM）、MMAIII单药组（1μM）、联合组。十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶后进行蛋白印迹（Western Blot）检测。特异性一次抗体为抗 Parp、Cleaved-parp、Cleaved-Caspase3（分别 1:1000稀释）；特异性二次抗体为HRP标记的抗兔或抗小鼠二次抗体。QuantityOne软件进行量化分析蛋白表达水平，β-actin蛋白水平作为内参。

1.6 酸性鞘磷脂酶活性测定 冻融法裂解细胞，应用BCA法测定蛋白浓度，用1mMPMSF稀释样品。每孔加入20μL被PMSF稀释的含20μg蛋白的样品液。向96孔板中加入样品液每孔20μL含20μg蛋白，每组两复孔。每孔加入30μL底物缓冲液K-3203水平摇床混合5min后每孔加入50μL稀释好的酸性鞘磷脂酶底物（酸性鞘磷脂酶底物k-3202：底物缓冲液k-3203=1：40）混合均匀后水平恒温摇床37℃孵育3h。在室温下每孔加入50μL终止缓冲液k-3204避光室温水平摇床孵育10min，多功能酶标仪激发波长360nm发射波长460nm下检测读板，软件Prism 6.0绘制曲线。

1.7 免疫荧光检测神经酰胺生成与聚集情况 隐丹参酮单药组、MMAIII单药组、联合应用组分别加药处理，0、1、2、4、8h 后收集细胞。用细胞涂片离心机（1500rpm，2min）将细胞转移到细胞爬片上晾干。干燥后的细胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次动作轻柔避免细胞从爬片上脱落。封闭液（含5%BSA的PBS溶液）封闭1h。一抗神经酰胺（ceramide，1：100稀释）4℃过夜。再用 PBS洗3次，5min/次。室温避光孵育二抗1h。再用PBS避12光洗3次，5min/次。在暗室中取出细胞爬片滤纸吸干多余的水分，将载玻片上滴加约10μL的不含DAPI的封片剂（Southern Biotech），将含有细胞侧的玻片轻轻覆盖在封片剂上，避免出现气泡。荧光显微镜下观察并拍照。

1.8 免疫荧光检测脂筏聚集情况 常规培养人多发性骨髓 U266细胞，接种于 24孔板中（4×104个/孔）待细胞生长至50～60%融合率后按空白对照组，联合应用组，Filipin组（filipin预处理2h后再加入隐丹参酮15μM和单甲基亚砷酸1μM）分别加药处理3h后收集细胞PBS洗2遍后。用细胞涂片离心机（1500rpm，2min）将细胞转移到细胞爬片上晾干。干燥后的细胞爬片放入4%多聚甲醛固定15min，再用PBS洗3次，5min/次动作轻柔避免细胞从爬片上脱落。封闭液（含5%BSA的PBS溶液）封闭1h。脂筏特异性荧光标记物霍乱毒素B（choleratoxinB，CTB）：37℃避光孵育1h，再用PBS避光洗3次，5min/次。在暗室中取出细胞爬片滤纸吸干多余的水分，将载玻片上滴加约10μL的含DAPI的封片剂（Southern Biotech），将含有细胞侧的玻片轻轻覆盖在封片剂上，避免出现气泡。激光共聚焦微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 单甲基亚砷酸联合隐丹参酮协同应用显著抑制多发性骨髓瘤细胞增殖 隐丹参酮浓度为15μM时细胞存活率为 （80.9±5.4）%（24h）、（60.0±8.4）%（48h），单甲基亚砷酸浓度为1μM时细胞存活率为（82.5±5.8）%（24h）、（67.7+9.7）%（48h），隐丹参酮（15μM）联合单甲基亚砷酸（1μM）作用于多发性骨髓瘤U266细胞24h、48h后细胞存活率为（29.1±7.0）%（24h）、（18.0±2.7）%（48h）。上述实验结果表明，隐丹参酮、单甲基亚砷酸对多发性骨髓瘤的增殖抑制作用呈浓度及时间依赖性，且隐丹参酮（15μM）及单甲基亚砷酸（1μM）联合作用U266具有显著的协同效应，其对细胞增殖的抑制作用明显优于单独应用（P＜0.01）（见插页图 1）。

图1 隐丹参酮单药组、单甲基亚砷酸单药组及联合用药组对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖抑制作用

2.2 单甲基亚砷酸联合隐丹参酮协同作用显著促进多发性骨髓瘤U266细胞凋亡发生 单甲基亚砷酸单药组（MMAIII，1μM），隐丹参酮单药组（CPT，5μM），联合用药组（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白对照组分别作用于对数生长期的多发性骨髓瘤U266细胞24h，经AnnexinV-FITC/PI染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果显示，联合用药组细胞凋亡率为（41.7±4.4）%、单甲基亚砷酸组为（10.6±4.0）%、隐丹参酮组为（10.5±3.0）%。上述结果显示联合用药组较单甲基亚砷酸单药组、隐丹参酮单药组能显著促进多发性骨髓瘤U266细胞发生凋亡（P＜0.01）（见插页图 2）。

图2 隐丹参酮联合单甲基亚砷酸协同作用显著诱导U266细胞凋亡发生

2.3 单甲基亚砷酸联合隐丹参酮协同作用能够活化多发性骨髓瘤U266细胞凋亡标记蛋白 单甲基亚砷酸单药组（MMAIII，1μM），隐丹参酮单药组（CPT，15μM），联合用药组（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白对照组分别作用于对数生长期的多发性骨髓瘤U266细胞24h后，收集细胞提取细胞总蛋白Western Blot法检测PARP凋亡蛋白活化情况，结果显示，联合作用组凋亡蛋白PARP剪切活化水平较单甲基亚砷酸单药组及隐丹参酮单药组有显著升高（见插页图3）。上述结果说明单甲基亚砷酸联合隐丹参酮通过活化凋亡标记蛋白进而诱导多发性骨髓瘤U266细胞凋亡发生。

图3 隐丹参酮联合单甲基亚砷酸协同作用促进U266细胞凋亡相关蛋白剪切活化

2.4 单甲基亚砷酸联合隐丹参酮协同作用促进多发性骨髓瘤U266细胞神经酰胺的生成 单甲基亚砷酸单药组（MMAIII，1μM），隐丹参酮单药组（CPT，15μM），联合用药组（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白对照组分别作用于对数生长期的多发性骨髓瘤U266细胞。收集细胞处理样本后，激光共聚焦显微镜下观察细胞膜上神经酰胺生成聚集情况。结果显示，上述药物作用2h，单甲基亚砷酸及隐丹参酮单独作用组神经酰胺荧光亮度与对照组无明显差别，联合用药组荧光亮度则明显增强（见插页图4），上述实验结果说明药物联合作用较单独作用显著促进人多发性骨髓瘤细胞神经酰胺的生成。

图4 隐丹参酮联合单甲基亚砷酸协同作用促进U266细胞膜上神经酰胺生成

2.5 单甲基亚砷酸联合隐丹参酮协同作用显著增加多发性骨髓瘤U266细胞的酸性鞘磷脂酶活性 单甲基亚砷酸单药组（MMAIII，1μM），隐丹参酮单药组（CPT，15μM），联合用药组（CPT15μM+MMAIII1μM）及空白对照组分别作用于对数生长期的多发性骨髓瘤U266细胞。收集细胞处理样本后，检测酸性鞘磷脂酶活性。结果显示，联合用药1h，能显著激活酸性鞘磷脂酶活性（见插页图5）。上述结果说明单甲基亚砷酸联合隐丹参酮联合用药能够激活多发性骨髓瘤U266细胞的酸性鞘磷脂酶活性，进而促进神经酰胺的生成。

图5 隐丹参酮联合单甲基亚砷酸协同作用活化U266细胞酸性鞘磷脂酶

2.6 脂筏抑制剂Filipin能够干预单甲基亚砷酸联合隐丹参酮诱导的多发性骨髓瘤U266细胞凋亡标记蛋白的剪切活化 空白对照组，联合用药组（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin组（脂筏抑制剂Filipin1μg/mL预处理 2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分别作用于对数生长期的多发性骨髓瘤U266细胞24h后，收集细胞提取细胞总蛋白Western Blot法检测 cleaved-Parp，cleaved-Caspase3凋亡蛋白活化情况，结果显示，脂筏抑制剂Filipin能够抑制凋亡蛋白cleaved-Parp，cleaved-Caspase3活化水平（见插页图6）。

图6 脂筏抑制剂Filipin干预隐丹参酮联合单甲基亚砷酸诱导多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的作用效应

2.7 脂筏抑制剂Filipin能够干预单甲基亚砷酸联合隐丹参酮引起的脂筏聚集 空白对照组，联合用药组（CPT15μM+MMAIII1μM）及 Filipin组（脂筏抑制剂Filipin1μg/mL预处理2h后再加入 15μMCPT和1μMMMAIII）分别作用于对数生长期的多发性骨髓瘤U266细胞3h后，收集处理样本，激光共聚焦显微镜观察。结果显示，联合用药后多发性骨髓瘤U266细胞膜上荧光强度增加，加入Filipin后荧光强度较联合用药减少。上述结果说明脂筏抑制剂Filipin能够抑制联合用药引起的脂筏在细胞膜上的聚集（见插页图7）。

图7 脂筏抑制剂Filipin能够干预单甲基亚砷酸联合隐丹参酮引起的脂筏聚集

3 讨论

已有文献报道，As2O3可以抑制多发性骨髓瘤细胞增殖及诱导其凋亡发生，研究结果显示，As2O3引起MM细胞线粒体膜电位发生变化，增大线粒体内膜通透性促进细胞色素C的释放激活Caspase家族蛋白诱导细胞凋亡发生[8-9]。MMAIII是中药砒霜As2O3在体内的活性代谢产物，其生物学活性远强于后者。As2O3进入人体后迅速在肝脏砷甲基转移酶的作用下转化为有机形态的活性代谢产物单甲基亚砷酸[10]。Wang等[11]发现MMAIII能够促进线粒体细胞色素C的释放诱导小鼠肝细胞凋亡发生。Chen等[12]报道，有机活性代谢产物MMAIII抗白血病和淋巴瘤细胞活性明显强于无机形态的As2O3，且对正常骨髓组织无毒副作用。本课题组前期研究发现，隐丹参酮（CPT）联合As2O3协同作用于多发性骨髓瘤U266细胞较单药作用具有更加显著的促凋亡效应[13]，在此基础上本课题组进一步探究As2O3活性代谢产物单甲基亚砷酸联合隐丹参酮的协同作用效果。

神经酰胺是重要的生物活性鞘脂类，作为第二信使广泛参与细胞信号转导[14-15]，在促进和调节许多包括细胞凋亡、分化、衰老等细胞过程中扮演着重要的角色[16-19]。有研究表明，这种调节作用与细胞膜上的神经酰胺，尤其与脂筏密切相关[20]。脂筏是一种筏状的膜结构域，由鞘磷脂及胆固醇聚集形成。胆固醇填充在鞘磷脂双层中的疏水空间内形成这种更紧凑的微区膜结构[21]。研究证实，脂筏在细胞信号跨膜转导中发挥着重要作用。大量受体分子或刺激分子可以引起酸性鞘磷脂酶（ASMase）的激活导致神经酰胺的释放，促使细胞膜上小的无活性的脂筏逐渐形成大的有活性的富含神经酰胺的平台结构，使得受体等信号分子跨膜转导[21-23]。脂筏抑制剂Filipin能够破坏脂筏的结构，阻止富含神经酰胺的脂筏平台形成，抑制信号的跨膜转导效应[24-25]。

本研究发现，隐丹参酮联合单甲基亚砷酸协同作用能够活化多发性骨髓瘤U266细胞酸性鞘磷脂酶活性，促进细胞膜上神经酰胺生成，迫使细胞膜上脂筏增大。联合用药1h能够显著活化U266细胞酸性鞘磷脂酶活性，联合用药2h能够促进U266细胞膜上神经酰胺的生成，酸性鞘磷脂酶的活化早于神经酰胺的生成，随着细胞膜上神经酰胺的增多脂筏不断的形成增大，并且下游凋亡蛋白的表达被激活。

综上所述，本研究得出隐丹参酮联合单甲基亚砷酸协同作用能够上调多发性骨髓瘤U266细胞酸性鞘磷脂的活性，促进细胞膜上鞘磷脂水解生成神经酰胺，进一步形成富集神经酰胺的脂筏并激活U266细胞下游凋亡信号通路。本研究结果表明，隐丹参酮联合MMAIII具有协同抗MM作用，有望为MM的临床治疗带来新思路。