宫颈癌细胞中转录因子RUNX2对促凋亡基因Bim的调控作用初步研究

杨煜鸿 张晓怡 王佳宁 陈卓峰 郭燕娴 许忆恩 赵经哲 黎鹏 王森（通讯作者）

（广东医科大学基础医学院组胚教研室 广东 东莞 523808）

1.引言

宫颈癌（Cervical Cancer， CC）是女性常见恶性肿瘤之一，严重危害女性生命健康。目前认为，宫颈癌与HPV感染关系密切，这一过程伴随着长期慢性炎症及其诱发的细胞凋亡的调节异常[1]。Bim是一种重要的凋亡调节蛋白，具有助凋亡活性，同时也具有肿瘤抑制因子的活性，Bim基因的缺失可导致多种肿瘤的发生[2]。本研究拟初步探讨宫颈癌细胞中RUNX2对Bim的调控作用。RUNX2属于Runxx蛋白家族一员，对肿瘤的侵袭能力具有重要的促进作用，RUNX2在宫颈癌、乳腺癌、肝癌的表达量明显增加，其异常表达与细胞转化和肿瘤进展同样密切相关[3]。然而，宫颈癌细胞中RUNX2对Bim的调控情况尚未清楚。因此，本实验初步探讨了RUNX2对Bim表达的影响，为进一步降低CC的转移和复发的治疗提供新的线索。

2.材料和方法

2.1 材料

宫颈癌Hela细胞和C33a细胞由本实验室保存。RUNX2表达载体由本课题组前期构建。细胞转染试剂Hilymax购自同仁化学研究所。逆转录试剂盒、PCR试剂购买自大连Takara 公司。PCR引物委托上海生工合成和测序。实时定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司，PBS粉末剂购自福州迈新生物技术有限公司，DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液购自上海生工。

2.2 实验方法

2.2.1 细胞培养及转染 宫颈癌细胞置于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。转染前24h取对数生长期的C33a细胞，经0.25%胰酶消化后显微镜下进行细胞计数，按每孔3×105个细胞的数量铺于6孔板中，设对照组和RUNX2组两组。以3μg质粒：15μL Hilymax的浓度进行转染。转染后4h换液，继续培养，等待后续实验。

2.2.2 总RNA 用TRIzol法提取，合成cDNA进行荧光实时定量PCR反应。Realtime PCR反应体系如下：首先取1μL cDNA作为模板，加入10μL SYBR Green Mix、0.8μL 10μmol/L上游引物、0.8μL 10μmol/L下游引物，7.4μLddH2O，混匀后以20μL体系进行定量PCR反应。引物序列：Runx2-F，5’-TCTTCACAAATCCTCCCC-3’；Runx2-R，5’-TGGATTAAAAGGACT TGGTG-3’；Bim-F Primers 5’-CAGACAGGAGCCCAGCACC-3'，Bim-R Primers 5’-TCCAATACGCCGCAACTCTT-3'.反应条件为95℃预变性10min；95℃变性15s、58℃退火30s、60℃延伸1min共40个循环。

2.3 统计学分析

运用SPSS19.0软件分析实验结果，使用两独立样本t检验（双侧）进行组间比较，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3.结果

3.1 C33a细胞过表达RUNX2下调了Bim的mRNA表达

将过表达RUNX2质粒转染宫颈癌C33a细胞后48h，提取总RNA，进行 qPCR实验检测RUNX2和Bim基因的表达。结果显示：与对照组相比，过表达组RUNX2 mRNA上升约41.2%（P＜0.05），表明C33a细胞成功转染了RUNX2基因。与对照组相比，BimmRNA降低约31.83%（P＜0.05），提示C33a细胞中RUNX2可以下调Bim基因mRNA的表达，见图1。

3.2 Hela细胞过表达RUNX2下调了Bim的mRNA表达

结果显示，与对照组相比，过表达组RUNX2 mRNA上升约61.72%（P＜0.05），表明Hela细胞成功转染了RUNX2基因。而Bim mRNA降低约40.01%（P＜0.05），提示RUNX2可以下调Bim基因mRNA的表达，见图2。

4.讨论

Runx2属于Runxx蛋白家族一员，由α和β亚单位组成的异二聚体构成，定位于人染色体6p12.3-p21.1。Runx2同时也是多瘤病毒增强子结合蛋白2/核心结合因子转录因子家族中的一员，在癌细胞中RUNX2可调节与肿瘤转移的相关标志蛋白表达[4]。研究证实，在宫颈鳞癌组织中，RUNX2蛋白的阳性表达率高于正常宫颈黏膜组织；且癌组织临床分期越高，其阳性表达率越高。另外，在宫颈高级别鳞状上皮内病变（HSIL）组织中，RUNX2也高表达，但低于宫颈鳞癌组织[5]。可见，RUNX2蛋白高表达与宫颈鳞癌的发生发展密切相关。

Bim是Bcl-2促凋亡蛋白家族成员之一，Bim基因作为抑癌基因，其沉默可导致肿瘤细胞凋亡通路的失敏，促使多种肿瘤的发生[6]。在目前研究中，通过免疫组化可评估在宫颈癌中BIM表达的相关性和预后意义。与正常子宫颈和低宫颈上皮内瘤（CIN）相比，在高CIN和宫颈癌中BIM高度表达[7]。可见，高Bim表达是宫颈癌潜在的预后标志物以及化学治疗靶标。

为了解Runx2对Bim的调控作用，我们应用qPCR技术检测过表达Runx2的宫颈癌C33a细胞和Hela细胞Bim的mRNA表达。结果显示较之于对照组，本实验中的宫颈癌C33a细胞和Hela细胞成功转染了Runx2基因；过表达Runx2下调了Bim的mRNA表达。宫颈癌细胞中RUNX2能够抑制Bim的表达，可能藉此途径抑制细胞凋亡促进肿瘤进展。

综上所述，本研究发现，宫颈癌细胞中过表达RUNX2抑制了Bim的表达，为将来进一步深入研究打下基础，也为宫颈癌防治提供潜在治疗靶点。

图1

图2