复方微粉ANBP对皮肤创伤早期小鼠FⅦ与ATⅢ含量影响的研究

陈 丽，张逸之，葛金文，赵思如，林飞阳，谭 滢，周忠志

皮肤作为人体最大最外部的器官具有调节体温、免疫、分泌和屏障等重要功能，但同时也极易遭受创伤[1]。如何加快并改善皮肤创伤修复逐渐成为人们生活中迫切需要解决的问题和医学领域的研究热点。皮肤创伤修复可以大致分成凝血止血期、炎症反应阶段、细胞增殖期和组织重塑期这4个阶段[2]。研究表明，凝血止血期的缩短对炎症反应的发展有重要作用，可减少全身多器官功能障碍综合征的发生，使创伤伤口加速愈合[3-5]，成为救治创伤患者的重要方法。

复方微粉ANBP是由仙鹤草(A)，乳香(N)，藕节(B)和蒲黄(P)这4种中草药按一定比例制成的粉末混合物，是治疗伤口愈合的经典良方，具有抗炎、镇痛、止血、凝血的作用。已知仙鹤草和乳香可被用于快速止血，缓解疼痛，伤口愈合和消除炎症。但关于复方微粉ANBP促进创伤愈合的具体研究机制目前尚未完全清楚。

机体的凝血系统包括凝血和抗凝血两方面，两者的共同作用保证机体出血时既可有效止血，又能防止血栓形成堵塞血流，从而维持机体内血液正常的生理流动状态[6]。本实验的目的是通过对小鼠背部创面在24h内进行肉眼观察和检测血清凝血因子(FⅦ)和抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)的含量变化，为进一步研究复方微粉ANBP对皮肤创伤模型小鼠的凝血与抗凝血功能的影响奠定基础，完善其对创伤愈合的研究机制。

材料与方法

1 材料与动物模型建立

鼠龄6～8周龄的无特定病原体(SPF级别)雌性C57BL/6小鼠30只，体重18～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司供给；水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司,250g/瓶，批号Q/12HB 4218-2009；复方微粉ANBP从湖南中医药大学第一附属医院购买仙鹤草、藕节、乳香和蒲黄4味中药，制备受专利权保护(201210467065.8)；FⅦ、ATⅢ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(CSB-E17817m、CSB-EL021079MO)购自武汉华美生物工程有限公司；多功能酶标仪(Enspire,美国Perkinelmer公司生产)；生化培养箱(SPX-250B-2,上海福玛公司生产)；高速冷冻离心机(Z32HK,德国生产)。

建立小鼠背部全层皮肤缺损模型[6]：将30只小鼠随机分为实验组(n=15)和对照组(n=15)。腹腔注射10%水合氯醛全身麻醉并维持。于小鼠背部脱毛消毒，用直径1cm打孔器制备皮肤缺损模型。实验组小鼠背部伤口予以复方微粉涂撒0.2g，尽量覆盖全部伤口。对照组不予任何处理。两组喂食、饮水、环境温度等其他条件相同。并于伤后1～3h、6h、12～24h(各10只)眼眶取血进行指标检测。

2 观察指标及方法

肉眼观察创面基本情况，用大小、厚度相同的滤纸贴于伤口，通过滤纸浸润面积来判断创面渗出及其干燥程度。小鼠全血FⅦ、ATⅢ浓度测定：眼眶取血后在8℃下静置2h后用低温离心机4℃ 3 000r/s 离心15min离心取得血清。严格按照说明书操作。终止显色反应后，5min内使用多功能酶标仪测定各孔在450nm波长下的光密度(OD值)。

3 统计学分析

结 果

1 肉眼观察

由图1可见，对照组小鼠背部创面在1～3h和6h时并无较大差别，湿润有少量渗出液体，在12～24h时存在轻微出血。实验组小鼠背部创面因有复方微粉覆盖，与对照组相比，在1～3h时液体渗出少，12～24h时创面无出血，粉末贴合，整体情况较对照组良好，而6h时创面较表现最为干燥，渗出最少。

图1 小鼠背面创面肉眼观

2 小鼠全血血清FⅦ含量检测结果

ELISA结果显示在创伤后24h内，对照组FⅦ含量持续上升。实验组FⅦ含量先上升后下降，呈开口向下抛物线状，于6h时达到(97.32±12.11)ng/mL，为观察期间含量高峰(P<0.05,见图2，表1)，较对照组(71.09±63.73)ng/mL含量表达增高，而12～24h时为(58.29±18.10)ng/mL，较对照组(89.87±61.34)ng/mL含量表达降低。

3 小鼠全血血清ATⅢ含量检测结果

ELISA结果表明，对照组与实验组ATⅢ浓度变化趋势相同，呈开口向上抛物线状，6h降至(17.36±7.89)ng/mL，为观察期间含量表达最低点(P<0.05,见图3，表1)，较对照组(22.55±6.48)ng/mL含量表达低。

表1 两组小鼠不同时间点FⅦ与ATⅢ浓度

*代表不同时间组的凝血因子Ⅶ浓度差异有统计学意义

图2全血血清凝血因子Ⅶ实验组浓度变化图

*代表不同时间组的抗凝血酶Ⅲ浓度差异有统计学意义

图3全血血清抗凝血酶Ⅲ实验组浓度变化图

讨 论

前期研究发现：(1)复方微粉ANBP具有促进人体皮肤创伤以及糖尿病小鼠创面愈合的疗效；(2)复方微粉ANBP具有减轻创面炎症反应的作用；(3)蛋白质组学分析表明跟凝血相关的蛋白在6h表达增加[7-9]。其中，第3点发现与本次实验研究结果基本符合。然而关于复方微粉ANBP是否能够通过影响创伤早期凝血与抗凝血功能尚未有确切研究。本研究通过对C57BL/6小鼠进行急性全层皮肤缺损创伤模型建立，探讨复方微粉ANBP对急性大面积创伤FⅦ与ATⅢ的动态影响分析。已知ATⅢ是主要的血浆抗凝物质，在血栓栓塞性疾病的形成和发展过程中起重要作用。当其含量增高时，则起抗凝作用，降低时则起促凝作用。FⅦ作为外源性凝血途径关键因子，其含量与血液凝血状态呈正相关。

实验结果表明，肉眼观察：与对照组相比，实验组6h时创面渗出液减少，更为干燥，不易出血；12～24h时创面粉末贴合，无出血无渗出。这可能与复方微粉在6h时FⅦ含量增加，之后逐渐降低的同时，ATⅢ含量逐渐上升有关。

FⅦ、ATⅢ含量：对照组FⅦ浓度渐增至12～24h，而实验组呈开口向下抛物线状，以6h为高峰出现说明实验组在创伤发生初时具有一定的促进FⅦ释放作用；在3～6h具有快速促FⅦ释放的作用。由此得出复方微粉ANBP可使得FⅦ在创伤修复过程中的高峰期提前，提示药物可能在创伤早期快速浓聚FⅦ而达到迅速止血目的，而后降低FⅦ浓度并与ATⅢ共同作用避免血栓形成；而两组ATⅢ浓度变化趋势均呈开口向上抛物线状，提示在ATⅢ实验组中药物在短时间内起到了一定的抑制抗凝血系统功能的作用。创伤用药后1～3h 复方微粉分别通过升、降FⅦ或ATⅢ浓度，加速创伤止血进程[10]；至6h时，FⅦ浓度达高峰，ATⅢ浓度至低谷，动态调节FⅦ与ATⅢ浓度控制伤口的出血；至24h使得FⅦ浓度降低的同时调控ATⅢ浓度处于较高水平，从而可能促进止血但又不使其血液处于高凝状态，防止急性创伤后的血栓形成，避免弥散性血管内凝血(DIC)的发生发展及降低微循环障碍概率，为之后加快愈合而减少瘢痕组织产生奠定基础[11-12]。

综上所述，复方微粉ANBP具有在创伤早期先增加FⅦ含量，而后增加ATⅢ含量的作用，也许可以满足创面早期急需止血和较晚期避免造成DIC前期血液高凝状态以及血栓等并发症发生的良好的、目前缺少的愈合特点。但对于其是否能够通过影响FⅦ及ATⅢ含量表达来对动态调节C57BL/6小鼠的凝血与抗凝血功能起到主要作用仍需进一步研究。这是由于中药复方内活性成分繁多，互相作用复杂以及靶点多方向性等特点和实验中存在的偶然误差的影响，复方微粉ANBP促进创伤愈合的具体机制还需进行更深一步的研究和探讨。