变换波长HPLC法同时测定药食同源降脂片中橙黄决明素、芦丁和槲皮素含量

陈静 丁洁 沙芮 李瑞宾 牛犇

摘要：采用Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1 mL/min，柱温40 ℃，波长切换（0～20 min，在370 nm波长下检测芦丁，20～30 min，在280 nm波长下检测槲皮素和橙黄决明素），进样量20 μL，流动相为甲醇（A）-水（B）。结果表明，橙黄决明素在1.977 2～98.860 0 μg/mL（R2=0.999 7）线性关系良好，平均回收率为98.81%，RSD为2.0 %;芦丁在1.958 0～97.900 0 μg/mL（R2=0.999 6）线性关系良好，平均回收率为98.16%，RSD为2.2%;槲皮素在2.283 6～114.18 μg/mL（R2=0.999 6）线性关系良好，平均回收率为100.44%，RSD为3.0%。药食同源降脂片中橙黄决明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD为1.36%;芦丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD为0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD为0.80%。该方法操作简便、准确、稳定、重复性好，可用于药食同源降脂片的质量控制。

关键词：高效液相色谱法（HPLC）;橙黄决明素;芦丁;槲皮素;药食同源降脂片

中图分类号：S132         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）02-0111-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.025           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

据2017年中国新近公布的流行病学资料显示，全国血脂异常的患病率为18.6%，现有患者1.6亿人，研究开发新型纯天然中药降脂类药物及保健品十分重要。目前临床上广泛应用他汀类药物来治疗高血脂症并预防心脑血管病症意外发生，疗效较显著。但长期或大剂量使用他汀类药物可能会导致心脏横肌纹溶解、肝脏组织细胞生物化学变化等严重不良反应[1，2]。

本研究所用的药食同源降脂片是由山楂（去核）、决明子、洋葱、黄瓜和枸杞等纯天然物质经过粉碎、提取、浓缩、干燥、打粉、压片而制得，具有降血脂、活血通经、益精血等作用。其中，决明子中的橙黄决明素[3，4]、山楂中的三萜酸和黄酮[5-8]、枸杞中的多糖和木耳多糖、洋葱中的蒜氨酸酶[9]等均对降低血脂有显著功效。且有研究表明，决明子和山楂配合在一起有较好的降血脂作用[10]。

决明子为临床常用中药，是国家卫生部公布的既是食品又是药品的中药材，临床应用表明其降脂作用明确[11]，疗效可靠、副作用少，但与其他传统中药一样，存在着成分复杂、机理不十分清楚等缺点。据近年来的研究报道，决明子中的专属成分橙黄决明素能显著增强LDLR基因转录水平，为决明子中有效降脂成分，已有基于GC-MS的代谢组学研究了橙黄决明素治疗高血脂症大鼠血浆中代谢物的变化，多元统计分析证实了橙黄决明素可以较好地调节高血脂症大鼠血脂水平。橙黄决明素作用于氨基酸及脂肪酸的代谢通路，能够达到较好的调脂作用。

山楂是一种常用中药，味酸、甘，性微温，归脾、胃、肝经，具有消食健胃、行气散疲功能，用于肉食积滞，胃脘胀满，泻痢腹痛，疲血经闭，产后疲阻，心腹刺痛，病气疼痛、高脂血症等。近年来，更廣泛用于治疗心血管疾病和抗菌消炎，引起国内外学者的注意和重视。山楂降压、增加冠脉血流量、降低血脂、耐缺氧、强心、抗心率不齐的有效成分为黄酮类化合物，其主要成分为芦丁、金丝桃普、槲皮素等，而黄酮类化合物的药理研究也显示降血脂作用[12]。故本研究选择橙黄决明素、芦丁和槲皮素作为药食同源降脂片的质量评价指标，建立了HPLC法同时测定药食同源降脂片中的橙黄决明素、芦丁和槲皮素含量，为该制剂的质量控制提供依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

橙黄决明素对照品（52850010）、芦丁对照品（E2260050）、槲皮素对照品（E3680050）购于上海安谱实验科技股份有限公司（纯度均>98%）;药食同源降脂片（甘肃省商业科技研究所，批号2017010606）;甲醇为色谱纯（Amethyst Chemicals，LCB0M02），水为去离子水，其他试剂均为色谱纯。

1.2  试验仪器

UPT-I-20L型落地式纯水机（四川优普超纯科技）;XS225A型电子分析天平（普利塞斯，瑞士）;LC-20A型高效液相色谱仪（岛津）。

1.3  方法

1.3.1  工艺流程  原料→分拣→粉碎→提取→过滤→浓缩→喷雾干燥→干粉→辅料配比→混合→湿法制粒→干燥→整粒→总混→压片→包装→成品。

1.3.2  溶液配制

1）对照品溶液。分别精密称取橙黄决明素、芦丁和槲皮素对照品0.004 95、0.004 93和0.005 82 g，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容成含橙黄决明素0.494 3 mg/mL，芦丁0.489 5 mg/mL，槲皮素0.570 9 mg/mL的标准储备液溶液。

2）供试品溶液。取药食同源降脂片20片，研细，精密称取细粉1 g，置10 mL量瓶中，加入淀粉酶溶液1 mL，调节pH在4～5。将样品溶液在室温下放置7～8 h，使药片中淀粉水解，加入纯甲醇溶液加热回流4 h，冷却后挥干溶剂，用甲醇定容至10 mL，经0.22 μm滤膜过滤，取滤液为供试品溶液。

1.3.3  色谱条件及系统适应性试验  色谱条件：Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样量20 μL。检测波长为0～20 min，370 nm;20～30 min，280 nm。流动相为水（A）∶甲醇（B）=70∶30。橙黄决明素、芦丁、槲皮素色谱峰分离良好。

2  结果与分析

2.1  线性试验

分别精密吸取橙黄决明素、芦丁、槲皮素混合对照品溶液，稀释至浓度为2、10、50、80、100 μg/mL。以进样量（μg）对峰面积（A）进行线性回归，得橙黄决明素、芦丁、槲皮素回归方程见表1，表明橙黄决明素在1.977 2～98.860 0 μg/mL线性关系良好，芦丁在1.958 0～97.900 0 μg/mL线性关系良好，槲皮素在2.283 6～114.180 0 μg/mL线性关系良好。

2.2  精密度试验

分别吸取橙黄决明素、芦丁、槲皮素储备液各10 μL，用甲醇定容至1 mL，连续进样6次，计算橙黄决明素、芦丁和槲皮素峰面积的RSD分别为0.53%、0.64%和0.52%，表明精密度良好。

2.3  重复性试验

取同一批药食同源降脂片，按“1.3.2”方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，结果显示橙黄决明素、芦丁、槲皮素平均含量为0.053 2、0.847 0和0.040 9 mg/g，RSD分别为1.36%、0.65%和0.80%。

2.4  稳定性试验

精密称取样品细粉1 g，按“1.3.2”方法制供试品溶液，分别于配制后0、2、8、16和24 h各进样20 μL，得橙黄决明素、芦丁和槲皮素色谱峰峰面积的RSD分别为1.24%、0.79%和1.46%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5  加样回收试验

取己知各成分含量的药食同源降脂片20片（橙黄决明素含量0.053 2 mg/mL，芦丁含量0.847 0 mg/mL，槲皮素含量0.040 9 mg/mL），研细后精密称取细粉0.5 g，共6份（相当于含橙黄决明素0.026 6 mg、芦丁0.423 5 mg、槲皮素0.020 4 mg），至10 mL容量瓶中，加入橙黄决明素对照品溶液54 μL（质量浓度0.494 3 mg/mL）、芦丁对照品溶液865 μL（质量浓度0.489 5 mg/mL）、槲皮素对照品溶液36 μL（质量浓度0.570 9 mg/mL），按“1.3.2”条件配制，进样测定，结果见表2。

2.6  样品含量测定

取3瓶样品，每瓶药品随机取3组药片，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果见表3。药片中橙黄决明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD为1.36%;芦丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD为0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD为0.80%。

3  讨论

关于高效液相色谱法同时测定芦丁和槲皮素含量的文献[13-15]较多，测定决明子中橙黄决明素含量的文献[16-18]也不少，但同时测定橙黄决明素、芦丁和槲皮素的方法尚未见报道，本研究通过多次尝试，根据3种物质的最大吸收波长，最终确定了通过变换波长法同时测定以上3种物质的高效液相色谱条件。关于流动相的选择问题，其他报道中测定以上3种成分的流动相多为甲醇、磷酸水及乙腈，本研究尝试采用甲醇和水作为流动相，仍然可取得较好的分离效果，达到了更加安全环保的成效，并可减少化学溶剂的使用。

4  结论

本试验建立了高效液相色谱法同时测定药食同源降脂片中橙黄决明素、芦丁和槲皮素含量的方法。结果表明，流动相为水（A）∶甲醇（B）=70∶30的条件下，橙黄决明素、芦丁和槲皮素可以较好得分离。该方法简便、快速、准确、可靠、重复性强，经测定药食同源降脂片中橙黄决明素平均含量0.053 2 mg/g，RSD为1.36%;芦丁平均含量0.847 0 mg/g，RSD为0.65%;槲皮素平均含量0.040 9 mg/g，RSD为0.80%，为药食同源降脂片的质控提供了依据。

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