烟草中甲霜灵残留快速检测试纸条研制

袁光宇 龚维瑶 罗维超 徐明慧 贾玲玲 谢体波 钟新敏 程茹

摘要：为开发快速检测烟草（Nicotiana tabacum L.）中的甲霜灵残留方法，以自制抗原、抗体为材料，研制一种胶体金免疫层析检测试纸条，并以甲霜灵原料合成半抗原，进一步制备抗原免疫后制备甲霜灵单克隆抗体。结果表明，纸条检测限对干烟草为1.5 mg/kg，鲜烟叶为1.0 mg/kg，与其他药物无交叉反应，且与色谱法比较符合率为98%，假阳性率为2.3%。甲霜灵残留试纸条检测烟草时样品处理简单、检测时间短、无需专业人员、经济适用等特点，能够实现烟草快速、准确、批量检测，可为烟草中甲霜灵残留检测提供技术支持。

关键词：烟草（Nicotiana  tabacum L.）;甲霜灵;试纸条;快速检测

中图分类号：TS207.5         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）02-0107-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.02.024           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

中国烟草（Nicotiana tabacum L.）种植历史悠久，烟草需求量随着经济的发展也越来越大。烟草在种植过程中常出现黑胫病、青枯病、根腐病等[1-3]，施药后农药残留情况不可避免。因此，烟草农药残留安全问题成为人们关注的焦点之一。

甲霜灵属N-苯基酰胺类高效内吸性杀菌剂化合物，对由真菌引起的黑胫病具有特异杀菌效果[4]。中国在农药残留标准中规定了农药甲霜灵在黄瓜、葡萄等瓜果蔬菜的最大残留限量分别为0.5、1.0 mg/kg[5]。而在烟草行业，由中国烟草总公司制定的企业标准中，规定了甲霜灵的最大残留限量为2.0 mg/kg[6]。

国内目前测定甲霜灵残留的方法多采用色谱法[7，8]，该方法不仅需要购买昂贵的色谱仪，而且需要专业人员来检测，不适合于现场快速检测及推广应用。贵州勤邦食品安全科学技术有限公司结合市场需求及农药残留检测现状，采用胶体金免疫技术研制出甲霜灵残留检测试纸条，具有高效、快速、低成本等特点，旨在為实现烟草中甲霜灵残留的快速检测提供一种检测手段。

1  材料与方法

1.1  材料

Balb/c小鼠（北京勤邦生物技术有限公司），甲霜灵、苯霜灵、恶霉灵、多菌灵、三唑酮、吡虫啉标准品（Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥99.0%），烟草（购自贵州省毕节、遵义、黔西南等地），弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、牛血清白蛋白、氯金酸、氯甲酸异丁酯（Sigma公司），柠檬酸三钠、柠檬酸钠、碳酸钾、甲醇等（国药集团），背板、硝酸纤维素膜、无纺布、金标垫、吸水纸（上海金标生物科技有限公司）。

HGS201型切条机、BioDot-XYZ3060型三维喷点平台、GL-21M高速冷冻离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司），90-2型磁力搅拌器（上海振荣科学仪器有限公司）、DHP-600S电热恒温培养箱。

1.2  方法

1.2.1  抗原合成  将甲霜灵原料溶于75%甲醇溶液，加入氢氧化锂30 ℃反应过夜，减压蒸馏冷却凝固得白色固体即为甲霜灵半抗原[9]，合成路径。称取适量甲霜灵半抗原溶于DMF，加100 μL氯甲酸异丁酯搅拌反应30 min后加入牛血清白蛋白缓冲液，4 ℃反应过夜即得甲霜灵抗原[10，11]。

1.2.2  单克隆抗体制备  将合成的甲霜灵抗原与弗氏佐剂混合按50 μg/只注入Balb/c小鼠皮下，使其产生多克隆抗体。免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株[10-12]。Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油7 d后，注射杂交瘤细胞株采集腹水，腹水经辛酸-饱和硫酸铵法纯化，抗体浓度标定至10 μg/mL。

1.2.3  胶体金的制备  去离子水将氯金酸稀释至0.02%，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，每100 mL氯金酸加入2 mL 1%的柠檬酸三钠，继续煮沸，液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水[13-15]。

1.2.4  试纸条最佳条件筛选  0.1 mol/L碳酸钾调节胶体金溶液的pH至6.8，设定甲霜灵抗体终浓度梯度为5、10、15、20、25、30 ng/mL，混匀静置30 min后加入10%氯化钠溶液[16]，筛选最佳抗体浓度。

0.1 mol/L碳酸钾调节胶体金溶液的pH至梯度5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，依次加入最佳抗体量，混匀静置30 min后加入10%氯化钠溶液，筛选最佳pH。

1.2.5  试纸条的制备  0.1 mol/L碳酸钾调节胶体金溶液的pH至最佳值，甲霜灵抗体终浓度最佳，混匀静置30 min后加入BSA至终浓度为2%，混匀静置30 min后4 ℃下12 000 r/min离心30 min，弃去上清液，缓冲液将沉淀重悬，重悬沉淀即为抗体-胶体金标记物。抗体-胶体金标记物经BioDot-XYZ3060三维喷点平台喷点到PB处理的金标垫上，恒温烘箱烘干。

0.02 mol/L PB分别将合成的甲霜灵抗原和羊抗鼠抗体稀释，喷点到硝酸纤维素膜上，构成T区和C区。将PB处理的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在背板上，切成4 mm宽试纸条。

1.2.6  检测方法及结果判读  取1 g烟叶剪成碎片，用5 mL甲醇浸满样品，振荡1 min，静置后移取0.15 mL混入1 mL PB稀释液。从包装袋取出试纸条，取3～4滴稀释液滴加于样孔中，反应5～10 min，判读结果。当质控区（C区）显示出红色条带，检测区（T区）不显色，判为阳性;当C区显示出红色条带，T区显示出红色条带，判为阴性;当C区不显示出红色条带，该试纸条判为无效。

1.2.7  试纸条试验  阴性干、鲜烟叶添加甲霜灵标准品至浓度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/kg进行样品检测，确定试纸条灵敏度。阴性干、鲜烟叶添加苯霜灵、多菌灵、三唑酮、吡虫啉至浓度5、10、20、50 mg/kg进行样品检测，判断试纸条特异性。

将采集自贵州各地的干烟叶27份、鲜烟叶23份分别进行试纸条检测和色谱检测[17]。试纸条检测结果判读阴性标记为“-”，阳性标记为“+”。色谱检测方法未检出的标记为“-”，其他以实际结果标识。

2  结果与分析

2.1  最佳抗体浓度

甲霜灵单克隆抗体筛选最佳抗体浓度结果。在5、10、15、20、25、30 ng/mL 6个梯度中，加入氯化钠后甲霜灵抗体终浓度为5和10 ng/mL时灰黑色较明显并递减，终浓度20 ng/mL后与15 ng/mL相比较，胶体金溶液颜色透亮，胶体金性质稳定。综合考虑抗体用量及与胶体金结合情况，选择终浓度20 ng/mL为甲霜灵单克隆抗体标记浓度。

2.2  最佳pH

以0.1 mol/L碳酸鉀分别调节胶体金溶液的pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，依次加入甲霜灵单克隆抗体至终浓度20 ng/mL，混匀静置30 min后加入10%氯化钠溶液，试验结果。结果显示pH在6.5、7.0时所得胶体金溶液性质稳定，无灰黑色沉淀。因此，反应最佳pH范围为6.5～7.0。

2.3  试纸条灵敏度

试纸条分别检测添加甲霜灵标准品浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/kg的干、鲜烟叶。干烟叶样品中甲霜灵浓度为0.5、1.0 mg/kg时，试纸条结果呈阴性（-）;干烟叶样品中甲霜灵浓度分别为1.5、2.0、2.5 mg/kg时，试纸条结果呈阳性（+），检测结果见表1。缩小甲霜灵标准品浓度添加为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mg/kg的干烟叶检测结果见表2，当检测浓度为1.1、1.2、1.3、1.4 mg/kg的干烟叶样品时，试纸条结果仍呈阴性;当检测浓度为1.5 mg/kg的干烟叶样品时，试纸条结果呈阳性。因此，该试纸条对干烟叶甲霜灵检测限为1.5 mg/kg。

鲜烟叶灵敏度检测结果如表3、表4所示，分析结果可知，该试纸条对鲜烟叶甲霜灵检测限为1.0 mg/kg。

2.4  试纸条特异性

分别检测向阴性干、鲜烟叶添加苯霜灵、恶霉灵、多菌灵、三唑酮、吡虫啉至浓度为5、10、20、50 mg/kg，检测结果见表5，阴性标记为“-”，阳性标记为“+”。其中，苯霜灵是甲霜灵结构类似物，恶霉灵常与甲霜灵混合使用，其他3种为烟草常用药物。试纸条检测结果显示5种药物均为阴性，即与其他药物无交叉反应，试纸条特异性强。

2.5  烟草检测

采集自贵州毕节、遵义等各地干烟叶27份、鲜烟叶23份，共计50份，干烟叶依次编号1-27，鲜烟叶依次编号28-50。分别以试纸条方法和色谱方法检测，甲霜灵试纸条干烟叶检测限为1.5 mg/kg，鲜烟叶为1.0 mg/kg。试纸条检测结果判读阴性标记为“-”，阳性标记为“+”。色谱检测方法，未检出的标记为“-”，其他以实际结果标识，结果如表6所示。由表6可知，试纸条检测与气相色谱仪检测烟叶中甲霜灵残留符合率高达98%，假阳性率2.3%。说明甲霜灵残留快速检测试纸条能对烟草中甲霜灵定性检测，但不能完全排除假阳性结果，对于阳性结果可以进行复检及气相色谱等方法进行确定。

3  结论

甲霜灵残留快速检测试纸条基于免疫胶体金技术，以胶体金作为抗原抗体免疫反应的示踪标志物[15]。半抗原的合成由甲霜灵原料一步反应完成，合成工艺简单，对物质本身的改造较少，半抗原制备抗原后经免疫能够获得特异性较强的抗体。胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原氯酸金，再与甲霜灵单克隆抗体复合得到Ab-胶体金标记物。标记试验中优化了甲霜灵单克隆抗体标记量及胶体金溶液pH环境，得到最佳的甲霜灵单克隆抗体标记量为20 ng/mL，最佳金溶液pH为6.5～7.0，并建立了甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物制备方案。

本研究中试纸条与甲霜灵类似物苯霜灵、恶霉灵及烟草常用药物（多菌灵、三唑酮、吡虫啉）之间无交叉反应，试纸条检出限为干烟叶1.5 mg/kg，鲜烟叶1.0 mg/kg。样品检测结果与色谱法检测结果相比符合率高达98%，说明试纸条检测结果稳定、可靠。使用本试纸条检测烟草样品与色谱法相比处理简单、检测时间短、无需专业人员、经济适用等特点，能够为烟草现场检测、抽查、管控提供便捷。

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