不同品种鸡BTN1基因序列差异分析

陈颖，郑圣晗，孔令琳，朱鹏飞，吴允，郭其新，陈国宏，常国斌

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

1961年Schierman和Nordskog将鸡的B基因座定义为主要组织相容性复合体( major histocompatibility complex，MHC)，由BF/BL、BG区域和Y区组成.BF/BL区域含有典型的MHC基因，BG区域决定红细胞抗原，这两个区域共同组成MHC的1个区域；Y区又称为遗传不连锁基因簇Y(restriction fragment polymorphism-Y， Rfp-Y)，单独为1个区域.92 kb的BF/BL核心区域共有19个基因，其中包括了BTN1(B-butyrophilin 1)基因[1-4].BTN1编码E3泛素蛋白连接酶TRIM39，而E3泛素蛋白连接酶是一个蛋白大家族，根据结构不同主要可分为HECT(homologous to E6-APC terminus)结构域、Ring结构域和U-box结构域等蛋白家族[5-7].在现有的关于肿瘤细胞生物学的研究中，发现E3泛素蛋白连接酶具有调控细胞凋亡、增殖及周期等功能.例如，E3泛素蛋白链接酶中的CHIP、BARD1/BRCA1、FBW7、Pirh2和WWP2在卵巢癌中均有抑制癌基因的作用[5].目前人类已经发现TRIM39家族的蛋白成员已经达到65个左右，从已有的报道中可知这个家族的重要性，这些蛋白与癌症、遗传性疾病以及神经系统异常等都有着密切的关系.例如先天性的opitz-G综合征与MID1基因的突变有着密切的关系；RFP与RET酪氨酸蛋白激酶结合形成致瘤性复合体参与肿瘤的形成.尽管这些蛋白发挥功能的具体机制目前还不清楚，但研究发现TRIM39家族成员在蛋白泛素化过程中发挥重要的功能[7-10].

至今尚无关于鸡BTN1基因的研究报道，尚不了解不同品种鸡BTN1基因之间的序列差异、候选抗病SNPs(单核苷酸多态性)位点以及InDels(插入和缺失).本研究对25个品种鸡进行目标序列捕获测序，并以NCBI上Gallus gallus(GG,Gene ID:693259)BTN1基因序列为参考，为探明国内外鸡品种之间BTN1 基因序列差异以及利用该基因的候选抗病SNPs位点和InDels为抗病育种提供参考依据.

1 材料与方法

本研究对25个品种鸡进行目标序列捕获测序，‘仙居鸡(XJ)’‘大骨鸡(DG)’‘茶花鸡(CH)’‘河南斗鸡(DJ)’‘藏鸡(ZJ)’‘白耳黄鸡(BE)’‘泰和乌骨鸡(WG)’‘固始鸡(GS)’‘狼山鸡(LS)’‘萧山鸡(XS)’‘鹿苑鸡(LU)’‘北京油鸡(BY)’这12个地方品种鸡来自中国农业科学院家禽研究所的国家地方禽种资源基因库.另外，‘安卡红鸡(AK)’‘罗斯鸡(RS)’‘如皋黄鸡(RG)’‘雪山草鸡(XC)’‘文昌鸡(WC)’‘隐性白羽肉鸡(YB)’‘太湖鸡(TH)’‘溧阳鸡(LY)’‘东乡绿壳蛋鸡(LD)’‘来航鸡(LH)’‘青脚麻鸡(QM)’以及‘广西黄鸡(GXH)’这12个品种鸡来自扬州大学动物科学与技术学院遗传资源实验室的禽种资源基因库，‘红色原鸡(HY)’亚种来自云南省野生动物救护中心[11].

采集翅静脉血，用酚仿法提取血液基因组DNA.每个品种的10个DNA样混池送深圳华大基因公司进行目标序列捕获测序.利用MEGA6.06软件将测序数据与参考序列进行比对，分析Intron、Exon的SNPs、InDels各个品种间的变异规律.各个品种鸡BTN1基因的Exon和Intron起始位点、终止位点与参考序列一致.

2 结果与分析

2.1 不同品种鸡BTN1基因的SNPs和InDels分析

为了探究我国不同地方品种鸡BTN1基因的序列差异，查阅NCBI上Gallus gallus(GG,Gene ID:693259)的BTN1基因序列，以此为参照.通过对比可知，25个品种鸡中BTN1基因Exon上共发现2个SNPs，无InDels，Intron上有70个SNPs和71个InDels.对不同品种鸡BTN1基因的Intron做SNPs分析(表1).Intron上的SNPs主要发生在Intron13、Intron18、Intron22和Intron23上，而InDels在大多数Intron上均有发生，但主要发生在Intron10和Intron13上，分别为4个插入和2个缺失、4个插入和3个缺失.其余Exon、Intron并无SNPs、InDels变化.

对25个品种鸡BTN1基因的Exon进行SNPs位点分析，Exon的SNPs位点主要位于Exon5、Exon17上(表2).如‘皋鸡’‘泰和乌骨鸡’‘红色原鸡’‘萧山鸡’‘青脚麻鸡’‘太湖鸡’和‘来航鸡’共同的错义突变均位于Exon5上.‘固始鸡’‘泰和乌骨鸡’‘雪山草鸡’‘萧山鸡’‘安卡鸡’‘太湖鸡’‘广西黄鸡’‘白耳鸡’和‘来航鸡’的共同的错义突变均位于Exon17上.表2中的‘泰和乌骨鸡’‘萧山鸡’‘太湖鸡’和‘来航鸡’有2个SNPs位点，其余品种鸡只有1个SNPs位点，而对于25个品种鸡的其他品种并无SNPs位点.

表1 Exon和Intron核酸变化表

碱基突变个数为在25个品种鸡上突变种类个数，D表示碱基缺失，I表示插入.

The number of base mutations indicates the number of mutations in 25 chicken breeds.D and I represent base deletions and insertions,respectively.

2.2 不同品种鸡BTN1基因系统聚类分析

利用MEGA6.06对26个品种鸡的BTN1基因进行比较分析，以探究BTN1基因在不同品种鸡上的同源性.选用Construct/Test Neighbor-Joining Tree(NJ)方法构建进化树，Bootstrap的值设置成1 000[12].

由图1可知，26个品种鸡中‘藏鸡’和‘茶花鸡’亲缘关系较近；其次，‘安卡红鸡’和‘白耳黄鸡’亲缘关系相近；‘如皋黄鸡’和‘来航鸡’亲缘关系相近，单独为一类.

前表示突变前的碱基或氨基酸；>后表示突变后的碱基或氨基酸；数字表示发生突变的位点.

before that the base or amino acid before mutation；>after that the base or amino acid after mutation;Numbers indicate the site of the mutation.

图1 不同品种鸡NJ进化树分析Figure 1 NJ phylogenetic tree analysis of different breeds

3 讨论

BTN1基因全长14 225 bp，位于鸡的16号染色体上，处于139 473～153 697的位置，包含了38个Exon和37个Intron.BTN1基因的序列较长，但是每个Exon只有20 bp，38个Exon只有两个有SNPs位点，而37个Intron中的SNPs或者InDels多达70个，表明BTN1上的Exon多态性低，Intron具有丰富的多态性.研究表明基因中的Intron虽然不参与蛋白质的编码，但是Intron对于蛋白质的调控和编码起到了重要的作用[13].试验结果显示SNPs和InDels数量在10个以上的Intron有Intron10、Intron13、Intron18、Intron22和Intron23，在它们之间还有一个有SNPs的Exon17，可以看出大部分的SNPs和InDels位点都是位于 Intron10和Intron23之间，即144 081～148 224之间，说明该区域具有丰富的多态性.

系统进化树的构建具有多样性，但是并无统一标准，系统进化树不同遗传计算方法也不一样.在科学研究中，可以根据试验目的进行选择.本研究为了方便、直观地解释不同鸡品种之间的亲缘关系，选用最常用的NJ树，并通过Bootstrap一致性处理[12].有研究发现中国地方品种鸡的杂合度值要明显高于欧洲地区的部分地方品种，并且我国许多地方家禽品种与其相比具有抗病力高、免疫能力强等特点[14-16].本研究中‘罗斯鸡’‘隐性白羽肉鸡’‘来航鸡’和‘安卡红鸡’属于国外品种，其余为我国地方品种.隐性白羽肉鸡与罗斯鸡作为主要的商业用鸡，两者均存在抗病力差的问题，尤其是先天免疫性能相对较差.通过序列比对结果发现，‘罗斯鸡’与‘隐性白羽肉鸡’在BTN1的外显子上均无SNPs位点，这可能对于选育抗病品系具有重要意义.王存波等[17]研究发现‘安卡红鸡’的抗病性较强.在本研究中，与罗斯鸡和隐性白羽肉鸡相比，‘安卡红鸡’和‘来航鸡’在BTN1的Exon17上有一个错义突变的SNPs位点，这可能是它们之间抗病力存在差异的原因之一.‘广西黄鸡’‘太湖鸡’‘泰和乌骨鸡’‘雪山草鸡’和‘萧山鸡’等具有适应性强、抗病力强等优良特性的品种在Exon17上均存在同一SNPs位点.同时，与抗病性较强的‘安卡红鸡’‘雪山草鸡’相比，‘来航鸡’在BTN1的Exon5上存在一个错义突变的SNPs位点.

我国地方品种鸡分布区域广泛，同一省份地方鸡种繁多，例如江苏省内的鸡品种就有‘狼山鸡’‘鹿苑鸡’‘溧阳鸡’‘太湖鸡’和‘如皋黄鸡’，但是在本研究中被分为3个大类，表明这5个品种鸡之间的同源性较低，亲缘关系较远.其他区域的品种鸡也不聚在同一大类，且大部分品种鸡拥有良好的生产性能和高抗病性，表明我国的地方品种鸡之间的同源性较低，很可能与我国地方品种鸡多样的生态类型以及丰富的遗传多样性有关.‘太湖鸡’‘泰和乌骨鸡’和‘萧山鸡’聚为一类，表明亲缘关系相近，且均具有适应性强，耐粗饲等优良特点.总体来说，相对于国外品种鸡，我国地方品种鸡的BTN1基因遗传变异更多样，反映了我国地方品种鸡具有丰富的先天免疫基因资源.

综上所述，BTN1基因的Exon17和Exon5上SNPs位点对抗病性具有一定意义，但具体功能还有待研究.在以后的研究中，我们可以充分利用这些遗传资源，以便探索我国优良地方品种鸡免疫性能的遗传机制，为鸡抗病育种奠定基础.