枸杞干果酒发酵过程中氨基酸组成的变化

丁学利

( 宁夏葡萄酒与防沙治沙职业技术学院，银川 750199)

枸杞子通常是人们对茄科枸杞属多年生落叶灌木—宁夏枸杞(Lyciumbarbaruv)果实的统称，其富含枸杞多糖、类胡萝卜素、甜菜碱、黄酮、多种维生素等多种营养成分和生物活性物质[1]，具有多方药理作用和生物活性功能[2]，如抗病毒、抗凝血、抗肿瘤、降低血糖、保护肾脏等[3-4]。枸杞发酵酒是以宁夏枸杞干果为原料，在控温条件下通过酵母菌发酵制成，可以较大程度保持枸杞原料的风味和生物活性成分，使营养成分更易于吸收，而且产品风味独特、多样，酒度较低，受众更广，更符合国内外饮料向天然、健康、保健发展的趋势，具有很大的发展空间和市场潜力，是枸杞深加工的趋势之一[5-8]。

枸杞中的主要含氮化合物为氨基酸，游离氨基酸的含量对所发酵的枸杞酒有重要的影响，将直接影响枸杞酒的酒精发酵[9]。研究表明，若发酵液中氮源缺乏或比例不合适，会对酿酒产生不良的影响，严重时会引起发酵停滞，并会产生过多的硫化氧、双乙酰，影响酒的香气物质形成，产生过多的高级醇，最终影响酒的品质[10]。近年来，人们对枸杞酒制作的工艺方法研究较多[11-15]，而对发酵过程中氨基酸的变化研究很少。因此，为进一步改善枸杞干果酒制作工艺、提高酒品质量，我们以不同发酵阶段枸杞酒为材料，分析了其在酒精发酵过程中氨基酸组成及其含量的变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

以干枸杞为材料，在10 t不锈钢发酵罐中进行发酵[16]，在原料添加的时候同时加入水、果胶酶和偏重亚硫酸钾，控温浸渍，然后调整成分，接种酵母，控温发酵。在这一过程中，按照比重变化，每隔24 h取一次样，样品编号依次为D1-D7，并以样品编号代表发酵过程中的不同时间。

氯化铵、浓盐酸、冰醋酸、硼酸、四硼酸钠均为分析纯，购自北京化工厂(Beijing,China)；三水合乙酸钠为分析纯，购自西陇化工厂(Guangdong,China)；乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、α-丙氨酸、GABA、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸均为色谱纯，购自Sigma(St. Louis,USA)；色谱纯乙腈和甲醇购自Fisher(Hampton, USA)，叠氮化钠购自生工(Shanghai, China)；超纯水取自Milli-Q 纯化系统。

高效液相色谱仪(SPD-M20A，日本岛津有限公司)，数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)，KQ3200DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FA204 电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，50 μl 微量进样器(上海高鸽工贸有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 酒样衍生化反应 枸杞酒中氨基酸含量用液相色谱法测定。将 875 μl的硼酸缓冲液(1 mol·L-1，pH=9)、37 μl甲醇、25 μl样品、485 μl纯水和15 μl乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯( DEEMM )置于2 ml离心管中混合均匀。将样品放入水浴中，超声35 min。后将样品置于70 ℃水浴内加热2 h，0.45 μm 的有机系滤膜过滤备用。

1.2.2 液相条件 色谱柱为Venusil XBP C18液相色谱柱 (4.6 mm×250 mm×5 m，Agela Technologies, 天津)。

流动相成分：有机相为乙腈与甲醇按4∶1 的比例混合；水相为带有0.02%叠氮化钠的25 mM、pH=5.8的醋酸缓冲液。流动相的流速为每分钟0.9 ml，检测波长280 nm，温度为室温，进样体积为20 μl，进样之前用0.45 μm 的有机系滤膜过滤。采用二元高压梯度洗脱，洗脱程序见表，通过比较相应标准品的保留时间和标准曲线确定氨基酸含量[17]。

表1 梯度洗脱条件

1.3 数据分析

利用Excel 2016进行标准曲线、相关系数和线性方程计算或模拟，利用SPSS v19 statistical software(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 枸杞酒主要氨基酸种类、含量和所占比例的变化

通过对不同发酵阶段枸杞酒的测定，一共检测出20种氨基酸，其中含有一种天然存在的非蛋白质氨基酸GABA，必须氨基酸8种，种类较为丰富。不同发酵阶段枸杞酒的游离氨基酸总含量为1 975.71～5 660.85 mg·L-1，发酵结束后的总游离氨基酸含量为1 975.71 mg·L-1。与李沁娅等[18]测定的11种保健酒游离氨基酸种类25种、必须氨基酸种类6种、总游离氨基酸含量32.17～1 799.14 mg·L-1，唐柯等[19]测定的47款中国产地葡萄酒游离氨基酸种类17种、氨基酸含量447.13～1 359.06 mg·L-1，沈颖等[20]测定的不同发酵温度下的荔枝酒含有14种氨基酸、含量为341.049～412.161 mg·L-1等相比，枸杞酒氨基酸种类丰富、含量高。同时与发酵前相比，枸杞酒发酵后氨基酸含量明显下降，表明在发酵过程中，微生物消耗了部分氨基酸[21]。在接种酵母之前，多数氨基酸的含量在逐渐升高，这可能与浸渍时间及添加果胶酶类直接有关，随着果胶酶对果胶类物质的分解和浸渍时间的延长，枸杞中的氨基酸逐渐浸出，含量增加。在接种酵母之前，其中脯氨酸、谷氨酰胺等8种氨基酸构成了氨基酸的主体，占比相对较大，其含量占氨基酸总量的94.6%；发酵结束后，在多数氨基酸含量不同程度下降的同时，这8种含量占氨基酸总含量的份额也下降至90.3%，氨基酸总量中脯氨酸、谷氨酰胺等7种氨基酸构成了氨基酸的主体，且这7种氨基酸含量在发酵前后变化幅度较小，而天冬氨酸含量占比由发酵前3.8%下降为发酵后1.5%，这可能与AlbertG等[22]认为的酵母菌可以利用天冬氨酸经过某种途径生成苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸有关。

表2 干果枸杞酒发酵前后主要氨基酸所占比

2.2 发酵过程中各种氨基酸含量的变化

测定发现在浸渍和发酵过程中，氨基酸的含量均为先上升后下降，这可能与浸渍和发酵速度有关系。刚接种酵母，酵母的浓度比较低，利用的氨基酸较少，而随浸渍时间的不断延长，氨基酸浸出越来越多，含量上升，之后随酵母活性的逐渐增强，氨基酸消耗增大，含量下降剧烈，最后达到最低值。其中，有16种氨基酸的最终浓度低于初始浓度。

图1 色氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和酪氨酸在发酵过程中浓度的变化

由图1可以看出，色氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、酪氨酸等4种氨基酸的初始含量均比较低，分别占初始含氨基酸总量的0.16%～0.29%，在发酵过程中，色氨酸和异亮氨酸的变化趋势比较类似即前期平缓上升，第四天达高峰，之后降幅较大；甘氨酸由第一天下降到第二天的低谷后一直上升，至第六天达到最高峰，之后再又大幅下降至最低值，发酵过程中的含量变化总体比较剧烈。这4种氨基酸中，色氨酸的消耗比例最大，最后含量仅为初始的22.6%，而且实际减少量也是这4种氨基酸中最大的，降低了6.86 mg·L-1。

图2显示，GABA、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等4种氨基酸含量为 36.11～127.32 mg·L-1，高于前面4种氨基酸，它们分别占初始总含量0.78%～2.95%，其中天冬氨酸初始含量较高，在发酵过程中，被大量的消耗，降低99.11 mg·L-1，最终含量仅为最后初始含量23.4%, GABA、亮氨酸、谷氨酸等3种氨基酸的变化趋势比较类似，在发酵过程中含量变化相对不大，约消耗了初始的一半以上，这4种氨基酸的最终浓度较为接近，介于14.01～48.34 mg·L-1。

图2 GABA、亮氨酸、谷氨酸和天冬氨酸在发酵过程中浓度变化

如图3所示，缬氨酸、苏氨酸、α-丙氨酸、丝氨酸等4种氨基酸的变化趋势较为类似，即前期比较平稳，中期降幅较大尤其是α-丙氨酸、丝氨酸，后期又比较平稳；结合比重分析，这4种氨基酸含量剧烈下降的中期(D4-D6)，也是发酵最为剧烈的时期，酵母的活动最旺盛，特别是对α-丙氨酸的利用量最大，消耗了初始含量的82%，在D5-D7期间，消耗量占整个过程消耗量99%，完全和发酵过程对应。为此，可以通过监测α-丙氨酸的变化来间接的监控发酵的过程。

图3 缬氨酸、苏氨酸、α-丙氨酸和丝氨酸在发酵过程中浓度变化

由图4所知，精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸等4种氨基酸初始浓度较高，发酵结束后浓度下降幅度相对不大，特别是脯氨酸发酵结束后含量依然占总含量的33.3%，且与其它3种不同，在发酵变化过程中的D6-D7时间下降最为剧烈，而在之前的过程中含量一直上升，其它3种氨基酸浓度都是前期一直上升或波浪式上升，至D4达最高峰，之后随着发酵的逐渐旺盛一直下降，最终分别达到低于各自的初始浓度。

图4 精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和脯氨酸在发酵过程中的浓度变化

从表3可以看出，在枸杞干果酒发酵过程中组氨酸和半胱氨酸含量虽有变化但差异不显著，表明这2种氨基酸几乎没参与和影响总氨基酸含量的变化，这可能和发酵的酵母有关，它们没有利用这2种氨基酸。甲硫氨酸含量随发酵时间延长先升高之后又降低，但最终含量为10.81 mg·L-1，比初始含量8.53 mg·L-1增加了26.7%，这可能因酵母的发酵作用，将其他物质代谢后为甲硫氨酸。

表3 枸杞干果酒发酵过程中的氨基酸含量 单位：mg·L-1

3 结论

高效液相色谱分析发现，枸杞干果酒发酵过程中，含有 谷氨酰胺、脯氨酸、天冬酰胺 等20种氨基酸，其中有8种必须氨基酸；发酵前游离氨基酸总量为4 379.61 mg·L-1，发酵结束后游离氨基酸总量为1 975.71 mg·L-1，发酵前各种游离氨基酸含量为6.65～1 325.61 mg·L-1，发酵结束后各种游离氨基酸含量为2.45～668.75 mg·L-1；发酵后16种氨基酸的含量分别下降，其余4种的含量分别上升或不变；发酵过程中的氨基酸含量变化趋势基本是先上升，后下降，最后达到最低值；与其他酒类相比，枸杞干果酒氨基酸种类丰富、含量较高。本实验仅对发酵过程中的氨基酸含量进行了测定研究，而未对参与代谢、合成过程的氨基酸种类进行研究，亦即没有最终确定酵母在酒精发酵中最需要的氨基酸种类，这也是我们今后研究的一个方向。