电针预处理对心肌缺血再灌注无复流大鼠NF-kB p65蛋白及其磷酸化水平的影响

陈晨,王琳晶,吴丹,吕晓琳,冯秋菊,黄树明



电针预处理对心肌缺血再灌注无复流大鼠NF-kB p65蛋白及其磷酸化水平的影响

陈晨1,王琳晶1,吴丹1,吕晓琳1,冯秋菊1,黄树明2

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院,哈尔滨 150001;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040)

观察电针预处理对大鼠心肌缺血再灌注无复流现象及核转录因子-kB(NF-kB) p65蛋白及其磷酸化水平的影响。48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、电针预处理组、阿托伐他汀预处理组。除假手术组外,其余各组大鼠均采用结扎左冠状动脉45 min后再灌注120 min的方法复制急性心肌缺血再灌注无复流的模型。观察各组大鼠心肌梗死、缺血及无复流的范围,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清炎性因子白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-a)的水平,蛋白质免疫印迹法(Western-blot)测定心肌组织中NF-kB p65及其磷酸化水平的表达。与模型组比较,电针预处理组和阿托伐他汀预处理组心肌梗死范围及无复流范围明显减小,电针预处理能显著升高心肌梗死大鼠血清IL-10水平,降低血清IL-6及TNF-a水平,下调心肌组织中NF-kB p65及phospho-NF-kB p65蛋白的表达,差异均有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。电针预处理能够显著降低心肌组织中NF-kB p65及其磷酸化水平的表达,从而改善心肌缺血再灌注后的无复流现象。

电针;心肌再灌注损伤;无复流现象;NF-kB p65蛋白;大鼠

无复流现象(no-reflow, NR)是指急性心肌梗死冠脉再通后,缺血区血供重新恢复但心肌组织仍然处于低灌注、甚至无灌注状态的一种现象[1]。调查研究发现,作为急性心肌梗死后的一个重要预测因子,约有30%～50%的患者在经皮冠状动脉介入术后出现无复流现象[2]。因此有效地防治无复流现象的出现成为成功治疗急性心肌梗死的关键。研究发现,针灸能够有效减轻缺血再灌注后的心肌损伤,但是目前尚无针灸防治缺血再灌注后无复流现象的报道[3-5]。本研究通过复制无复流大鼠模型,观察大鼠炎性因子及心肌组织中NF-kB p65及其磷酸化水平的表达,探讨电针对心肌缺血再灌注无复流现象的影响及其部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

48只SPF级雄性SD大鼠,体质量(280±15)g,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供,适应性饲养1周后,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、电针预处理组和阿托伐他汀预处理组,每组12只,实验过程严格遵照科技部(2006)398号《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求执行[6]。

1.2 实验方法

1.2.1 电针预处理组

将大鼠固定于实验台上,将0.25 mm×25 mm的毫针刺入双侧内关、心俞及膻中穴,穴位的选取参照《实验针灸学》[7]中相关穴位的定位方法取穴。内关采用直刺法,心俞采用斜刺法,膻中采用平刺法,进针后采用平补平泻手法行针1 min后连接Han-200电针仪。连接方法,同侧穴位以内关连接心俞穴,膻中在其旁开0.5 cm处另刺入一针作为辅助电极,选连续波,频率2 Hz,强度1 mA,每日1次,连续7 d。

1.2.2 阿托伐他汀预处理组

于造模前给予阿托伐他汀混悬液15 mg/kg灌胃,每日1次,连续7 d。

1.2.3 假手术组

给予等量的生理盐水灌胃,每日1次,连续7 d。

1.2.4 模型组

给予等量的生理盐水灌胃,每日1次,连续7 d。

1.3 模型制备

参照韦星等[8]方法,大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠后仰卧固定于动物实验台上,气管插管后并调整呼吸参数。于胸骨左缘第2至第4肋做一纵行切口,剪断肋骨并充分暴露心包。剪开心包膜后并剔除心底的脂肪组织,用带缝线的小圆针自肺动脉圆锥和左心耳处结扎冠状动脉左前降支,假手术组只做穿线处置,而不结扎冠状动脉。结扎处理45 min后松解结扎线以恢复血流,恢复灌注时间为120 min。

1.4 指标检测

1.4.1 缺血、梗死和无复流范围

再灌注120 min后自尾静脉注射硫磺素S(1 mL/kg)后结扎左灌注动脉前降支,自下腔静脉注入2 mL 1%伊文斯蓝,1 min后取出心脏并冲洗,﹣80℃冰冻保存10 min后沿长轴方向以2 mm的间隔切片,置于荧光显微镜下拍照并保存。然后将心肌切片放入氯化三苯基四氮唑缓冲液中染色,扫描仪扫描并保存。分别计算各组大鼠心肌组织缺血率(RA=缺血面积÷左心室面积)、梗死率(IS=梗死面积÷缺血面积)和无复流率(ANR=无复流面积÷缺血面积)。

1.4.2 血清炎性因子

造模结束后于颈动脉插管采血,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定大鼠血清炎性因子白细胞介素-10(Interleukin -10,IL-10)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-a)的水平。

1.4.3 心肌组织中NF-kB p65蛋白

RIPA裂解液裂解左心室游离壁心肌组织,离心后取上清BCA法测定蛋白质浓度。SDS-PAGE电泳后将PVDF膜置于电泳转移缓冲液中浸泡。封闭后加入一抗NF-kB p65、phospho-NF-kB p65、b-actin及辣根过氧化物酶标记的二抗。ECL显影后拍照,以Image J软件分析各组条带,以b-actin为内参,计算各蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,多组间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用法。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠缺血、梗死和无复流范围的比较

由表1可见,电针预处理组和阿托伐他汀预处理组大鼠心肌缺血范围较模型组减小,但差异无统计学意义(＞0.05);心肌梗死范围及无复流范围较模型组明显减小,差异有统计学意义(＜0.01)。

表1 各组大鼠缺血、梗死和无复流范围的比较 (±s,%)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.2 各组大鼠血清炎性因子水平的比较

造模后大鼠血清IL-10水平显著增高,血清IL-6及TNF-a水平增高,与假手术组比较差异有统计学意义(＜0.01);电针预处理和阿托伐他汀预处理组能够显著升高心肌梗死大鼠血清IL-10水平,降低血清IL-6及TNF-a水平,与模型组比较差异有统计学意义(＜0.01)。详见表2。

表2 各组大鼠血清炎性因子水平的比较 (±s,pg/mL)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01

2.3 各组大鼠心肌组织中NF-kB p65蛋白表达的比较

造模后大鼠心肌组织中NF-kB p65及phospho- NF-kB p65蛋白表达显著增加,与假手术组比较差异有统计学意义(＜0.01);电针预处理和阿托伐他汀预处理组能够显著降低心肌组织中NF-kB p65及phospho- NF-kB p65蛋白的表达,与模型组比较差异有统计学意义(＜0.01,＜0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中NF-kB p65蛋白表达的比较 (±s)

注:与假手术组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01,3)＜0.05

3 讨论

再灌注无复流是指血管再通后虽无机械性梗阻,仍存在心肌有效灌注不足的一种现象,其不仅显著增加心肌再梗死率,还能引起心源性猝死和心室重构等严重不良后果[9]。NR病理机制复杂,但是越来越多的研究发现,其与炎症反应存在密切的关系[10-11]。心肌缺血能够诱导心肌和血管内皮细胞的肿胀,当再灌注时产生大量的氧自由基,从而趋化白细胞产生炎症反应释放多种炎症介质,引起微循环的阻塞和毛细血管通透性增加,最终导致无复流的发生。IL-6和TNF-a作为重要的促炎性细胞因子,与心肌缺血及再灌注密切相关,能够通过趋化、激活中性粒细胞促进炎症反应的发展,介导内皮细胞、微循环的损伤,从而加重再灌注损伤和无复流的发生[12-17]。IL-10主要由T淋巴细胞和单核巨噬细胞产生,其能够通过抑制IL-6、TNF-a的产生从而调控炎症反应,是当前备受关注的抗炎介质之一[18-19]。研究证实,在缺血再灌注的早期即可产生大量的IL-10,通过抑制心肌组织中性粒细胞的聚集,起到保护作用[20-22]。

治未病是中医药防病保健的理论基础,早在《针灸聚英》中就有针灸预处理治未病的记载“无病而先针灸曰逆。逆,未至而迎之也”。尽管近年来研究发现,针灸的双向良性调节作用在机体处于稳态时,其兴奋性或抑制性效应都相对微弱或者不明显,但是针灸的适宜刺激,能够通过稳定和增强器官的系统机能和抗扰动能力,达到防病保健的目的[23-26]。如同心肌缺血预适应一样,研究发现针灸预处理能够有效推迟心肌梗死发生的时间,减少梗死的范围,还能够降低室性心律失常的发生及程度,达到内源性的保护作用[27]。生物膜通透性增加引起的细胞内钙稳态的破坏,在再灌注的进展中发挥着重要作用[28]。研究发现,电针预处理参与了细胞内钙稳态的调节,这可能是针灸防治缺血再灌注损伤的内源性机制之一[29]。

本研究采用结扎冠状动脉后恢复血流复制心肌缺血再灌注无复流模型,通过电针内关、心俞及膻中穴进行预处理。内关穴为八脉交会穴之一,又是手厥阴心包经的络穴。有动物研究发现,电针内关穴能够上调心肌d阿片受体基因的表达,从而起到保护心肌再灌注损伤的作用,减少心肌梗死的范围[30]。心俞穴属于足太阳膀胱经穴,心之背俞穴,具有通络安神、宽胸理气的作用。宋春华等[31]研究发现,电针心俞穴预处理能够有效减少再灌注大鼠一氧化氮及过氧化氢酶含量,从而起到保护心肌的作用。膻中穴属于任脉的经穴,为八会穴之气会。研究发现,膻中穴具有舒张血管平滑肌、扩张冠状动脉的功能[32]。笔者的研究结果发现电针能够显著减少心肌梗死及再灌注无复流的范围,并且能够调控大鼠血清抗炎因子和促炎因子的水平。NF-kB作为炎症反应的始动环节,能够调控下游炎性因子的表达,对再灌注后无复流的发展起着重要的作用[33-37]。本研究通过检测心肌组织中NF-kB p65蛋白及其磷酸化水平发现,电针预处理能够显著下调NF-kB p65及phospho-NF-kB p65蛋白的表达。

综上所述,电针内关、心俞、膻中能够改善心肌缺血再灌注后的无复流现象,其作用机制可能是通过调控NF-kB p65蛋白磷酸化水平,从而调控下游炎性因子的表达实现的。

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The Effect of Electroacupuncture Pretreatment on NF-kB p65 and Its Phosphorylation Levels in Rats with Myocardial No-reflow After Ischemia-reperfusion

1,-1,1,-1,-1,-2.

1.,150001,; 2.,150040,

To observe the effect of electroacupuncture pretreatment on myocardial no-reflow after ischemia-reperfusion, NF-kB p65 and its phosphorylation levels in rats.Forty-eight male SD rats were randomized to sham operation, model, electroacupuncture pretreatment and atorvastatin pretreatment groups. A model of myocardial no-reflow after acute ischemia-reperfusion was made in all the groups except the sham operation group. The model was made by left coronary artery ligation for 45 min and subsequent reperfusion for 120 min. The extents of myocardial infarct, ischemia and no-reflow were assessed in every group of rats. Serum inflammatory factors interleukin-10 (IL-10), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor (TNF-a) levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Myocardial expressions of NF-kB p65 and phospho-NF-kB p65 were determined by Western blot.The extents of myocardial infarct and no-reflow were significantly reduced in the electroacupuncture pretreatment and atorvastatin pretreatment groups compared with the model group. Electroacupuncture pretreatment could significantly raise serum IL-10 levels, reduce serum IL-6 and TNF-alevels and down-regulate myocardial expressions of NF-kB p65 and phospho-NF-kB p65 with statistically significant differences (＜0.01,＜0.05).Electroacupuncture pretreatment can significantly decrease myocardial expressions of NF-kB p65 and phospho-NF-kB p65 to reduce myocardial no-reflow after ischemia-reperfusion.

Electroacupuncture; Myocardial reperfusion injury; No-reflow phenomenon; NF-kB p65; Rats

1005-0957(2019)03-0336-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.03.0336

2018-11-07

黑龙江省青年科学基金项目(QC2017118);黑龙江中医药大学科研基金项目(201710)

陈晨(1985—),男,主治医师,硕士,Email:cc13936695663@163.com

黄树明(1958—),男,教授,博士生导师,博士,Email:huangsm1958@163.com