益肾养血法对未孕超促排卵大鼠子宫内膜容受性的影响

林 波

(皖西卫生职业学院护理系，安徽 六安 237005)

不孕症是目前危害人类生殖健康的主要疾病之一，且有日益增加的趋势[1]。而子宫内膜容受性成为制约临床妊娠率提高的关键因素。促排卵应用的大量性激素类药物会对子宫内膜容受性产生不良反应[2]，中医认为补肾活血法可以使肾精充足，胞宫气血通畅，则可摄精容物及受孕，但其机制尚不明确。因此，本研究探讨了益肾养血法改善未孕期超促排卵大鼠子宫内膜微环境的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级健康SD雌性未孕大鼠120只，体质量为(210±10)g，按随机数字法分为3组，分别为：空白组(生理盐水组)、模型组(GnRHa+PMSG+HCG)、中药组(GnRHa+PMSG+HCG+中药)。对大鼠进行适应性喂养，连续5天后，实施阴道涂片，每日1次，动情期明确后，观测大鼠10 d。

1.1.2实验药物 益肾养血法中药组成：鹿角胶8 g，黄芪10 g，山药10 g，川续断10 g，丹参10 g，菟丝子10 g，当归15 g，熟地黄15 g。将上述7味药加水浸泡半日，以没过中药为准，共煎药2次，每次30 min，过滤药渣，将2次药液合并，浓缩至1.8 g/mL，置凉后放入冰箱冷藏，以备实验使用。西药：孕马血清(PMSG),促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)，人绒毛膜促性腺激素(HCG)。

1.2 研究方法

1.2.1给药和造模 中药按每组9 g/(kg·d)给药，模型组及空白组依据体质量给予5‰CMC(羧甲基纤维素)灌胃。阴道涂片法确认动物不再发情，即开始给药。模型组、空白组、中药组每日灌胃1次，剂量是1 mL/100 g，持续3个动情期，每隔7天称重以便调整药量。自大鼠第4个动情周期第3 d始，每日中药组和模型组于腹腔注射促性腺激素释放激素激动剂1.5 μg /100 g体质量，连续7 d，第8 d同时注射孕马血清40 U/100 g体质量，第9 d下午1时注射人绒毛膜促性腺激素100 U/100 g体质量。每天空白组注射生理盐水，剂量等同中药组和模型组，连续9天。

1.2.2标本采集 空白组排卵后(阴道涂片出现排卵征象)第2、3、4、5、6 d各处死大鼠6 只，模型组和中药组于注射hCG后第2、3、4、5、6 d各处死大鼠6 只 。大鼠称重后，10%水合氯醛(0.33 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速剖腹取出子宫，放入4%多聚甲醛固定液中固定，以备用于免疫组化等检测。

1.2.3指标检测 采用免疫组化法。取标本放入枸橼酸盐缓冲液中进行微波抗原修复，分别EGF/EGFR抗体孵育，二抗孵育，DAB显色，显微镜下观察各组EGF/EGFR表达[5]。EGF和EGFR阳性表达均分布于细胞膜或胞质中，呈棕黄色颗粒样物质。MVD检测采用兔抗人多克隆CD34抗体(北京利科丽生物有限公司)，先在低倍镜下选择最密集血管区域，再在400倍高倍镜下选择3个区域，平均其值即得。判断标准：血管内皮细胞团或者细胞单体，与其他细胞境界清楚可判定是微血管[5]。

2 结 果

2.1 大鼠子宫内膜MVD比较

与空白组相比，模型组子宫内膜MVD显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，中药组大鼠子宫内膜MVD明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 大鼠子宫内膜EGF表达比较

与空白组比较，模型组子宫内膜EGF表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组与模型组相比，中药组大鼠子宫内膜EGF表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 大鼠子宫内膜EGFR表达比较

与空白组比较，模型组大鼠EGFR表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组与模型组相比，中药组大鼠子宫内膜EGFR表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1 大鼠子宫内膜MVD比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

表2 大鼠子宫内膜EGF表达比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

表3 大鼠子宫内膜EGFR表达比较

注：与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3 讨 论

子宫内膜受容性是指在种植窗期，子宫内膜表现出最大的容受性，并且受到严格的时间-空间限制，子宫内膜上皮细胞及基质细胞均发挥着重要作用[3]。各种细胞因子、生长因子的表达与子宫内膜容受性密切相关。EGF在正常机体内环境中以活性物质存在，主要成分是53个氨基构成活性多肽，可与其受体EGFR紧密结合，两者水平的变化直接影响子宫内膜受容性。盛威等[4]报道，在大鼠子宫内环境中，能够突出表达血管生成相关表皮生长因子，例如EGF、EGFR因子等，同时在性激素作用下，改善子宫内膜分化、生长、受孕等情况。另外，研究[4]证实了当雌激素消失时，EGF与受体EGFR结合，在两者的相互作用下，ERK通路被激活，有利于加速子宫内膜上皮的增殖。子宫内膜容受性不仅和表皮生长因子表达有密切联系，还受到血管生成的影响。测量MVD是一种常见的间接测量血管生成的方式[5]，在子宫内膜中应用更加广泛，因此能够特异性标记子宫内膜受容性[6]。

GnRHa长方案是经典的COH方案，目的是抑制内源性LH分泌[7]。然而着床的成功，不仅仅需要具有种植能力的胚囊，还需要同步发育的可接受胚胎着床的子宫内膜。迄今为止，国内外西医学还没有发现有效提高子宫内膜容受性的方案[8]，大大制约了生殖技术的发展进步。而从中医角度来看，子宫内膜容受性减少常与肾虚有关，所以本实验探讨了益肾养血法是否在未孕超促排卵模型大鼠子宫内膜中起到改善和治疗作用。在中医学范畴并没有提出子宫内膜容受性的内容，然而，针对子宫内膜容受障碍引起的一系列表现，可以定义为“胎漏”“月经不调”“胎动不安”“不孕症”“滑胎”，这和肾精、气血有着密不可分的关系。中医学认为，“肾-天癸-心(脑)-冲任-胞宫轴”能够调控月经来潮，与西医的“下丘脑-垂体-卵巢轴”观点相同。月经后期阴长为主，子宫主藏。子宫藏而坚固不泻，更能促进持续滋养肾水，有利于卵子的生长发育，充盛血海(子宫内膜)，充盈精液，然后阴长至重，重阴转阳，促进子宫排卵，反复行泻的作用，如此周而复始阴阳消长，月经才能以正常时间来潮。《黄帝内经》曾记录“胞络者，系于肾”，又因为任脉与肾脉两者共同交于关元之穴，与冲脉向下并行，与督脉相交，贯脊属肾，所以，肾精通过任脉、冲脉、督脉三者与子宫直接相关。有研究结果[9-10]显示，补益肾气的中药能够增加子宫内部的血液流通，并且能够提高子宫上皮细胞中脂肪以及糖蛋白的数量，进而加强子宫内环境的营养，补血养阴的中药则能够增加机体雌、孕激素的受体数量，与相关因子紧密结合，活血化瘀中药能够改变微循环障碍，调节子宫内膜的不良情况 。郭佳等[11]从子宫内膜容受性的角度出发，研究补肾养血中药对超促排卵周期干预作用的随机对照实验，结果发现，中药可以上调血清孕酮及子宫内膜LIF表达，提高子宫内膜容受性。

本实验益肾养血法中药方源于经验方，首先以鹿角胶、菟丝子、川断补肾助阳，加入当归、熟地，遵循“女子以血为本”的中医理论，同时女子月经来潮消耗过多阴血，血常不足，所以不能添加温燥性烈的中药，避免阴液亏损，同时也有张景岳所倡导的阴中求阳的用药原则，从而达到暖宫种子的目的。但因阴阳互根，阳分难以“重”，方中加入活血化瘀的药物，如丹参能够加速气血运行，改善微循环障碍，可以达到创造生殖内环境中的阴阳平衡，促进受精卵的着床。又因乙癸同源，肾水主一身之阴，肾水涵养肝木，加上肝脏得以正常疏泄，肝血疏泄有度，有利于卵子规律排出，加大受孕的几率。另外，足厥阴肝经行于少腹部，恰好卵巢与子宫都在少腹部位，卵巢的正常排卵、输卵管运输顺畅均在肝经循行部位，女性在排卵期引起的小腹、乳房胀痛等都说明肝经与子宫排卵有着密不可分的关系[12]。全方立足于肾主生殖，旨在调理阴阳，恢复、维持阴阳的动态平衡，达到改善子宫内环境的目的。

本实验结果显示，与模型组相比，中药组子宫内膜MVD明显增加，EGF、EGFR表达显著增强，差异有统计学意义(P<0.05)；说明益肾养血的中药能够显著调节子宫内膜微环境状态，使未孕期大鼠子宫内膜MVD 和表皮因子EGF、EGFR表达水平增加，提高了子宫内膜容受性，为胚胎着床提供了 “更肥沃的土壤”。益肾养血法可能通过以下机制起到改善内膜微环境的治疗作用：①改善血管生成从而调节子宫微环境；②调节子宫内膜EGF、EGFR的表达，增加子宫内膜的生理容受功能。

此次研究中我们从现代医学的角度探索中医益肾养血法调节子宫内膜微环境的机制，为临床中医增加妊娠成功率提供科学的理论基础。