舒脑欣滴丸中阿魏酸含量及其人血清白蛋白结合率研究

于秋红 高召军 能 婷 齐永秀

(山东第一医科大学药学院，山东 泰安 271016)

舒脑欣滴丸是由川芎、当归两味药制成，具有理气活血、化瘀止痛之功效[1]。阿魏酸是当归中的重要药效成分之一，具有抑制子宫平滑肌收缩，抗血小板凝集和抗血栓，抗心肌缺血和扩张血管作用[2-3]。药物血浆蛋白结合率是临床合理用药的依据,是药物体内重要参数之一，可直接影响药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，从而影响其作用强度与时间，是药代动力学、分子药理学等学科研究的重要课题之一[4]。目前，用于测定阿魏酸含量的方法较多[5-7]，而测定阿魏酸血浆结合率的文献较少，本次实验采用HPLC法和超滤法测定舒脑欣滴丸中阿魏酸含量和血清蛋白结合率，为临床安全合理用药和新药的研究提供数据。

1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪；2998二极管阵列检测器；FR224CN型电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；岛津UV-2700型紫外分光光度计；凯特离心机(盐城凯特实验仪器有限公司)；XW-80A旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；Millipore 10K超滤管(北京明阳科华生物科技有限公司)；阿魏酸对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：H27J7L16718)；舒脑欣滴丸(天津中新药业集团股份有限公司)；人血清白蛋白(HAS，250 mg，Sigma公司)；甲醇(色谱纯，天津市永大化学试剂有限公司)；乙酸(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：VenusilMPC18(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水-乙酸(40∶59.6∶0.4)；检测波长为323 nm；柱温为30℃，流速1.0 mL·min-1；进样量20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸标准品5 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容到刻度，摇匀，得到浓度为200 μg·mL-1的阿魏酸对照品储备液，置于4℃冰箱保存备用。

2.2.2样品溶液的制备 取舒脑欣滴丸20丸，精密称定，计算平均丸重，再随机取5丸粉粹，称重后置于10 mL容量瓶中，加入70%甲醇适量，超声处理30 min，冷却，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.3磷酸盐缓冲溶液的制备(PBS，pH=7.4) 称取磷酸二氢钠2.08 g，十二水磷酸氢二钠19.028 g，氯化钠4.4 g，置于1000 mL的容量瓶中，加入水适量，超声溶解后加水稀释至刻度，摇匀，即得到pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。

2.2.4人血清白蛋白溶液的制备 精密称取人血清白蛋白0.08125 g，置25 mL的容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液溶解并稀释至刻度，可得3.25 mg·mL-1的人血清白蛋白溶液，置于4℃冰箱中储存备用。

2.2.5人血清白蛋白对照品溶液制备 精密称取阿魏酸对照品1 mg，置10 mL容量瓶中，加人血清白蛋白溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为100 μg·mL-1的人血清白蛋白对照品溶液；再精密吸取适量，稀释成50、10、5 μg·mL-1的人血清白蛋白对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1专属性试验 取500 μl人血清白蛋白溶液置超滤管中，于10000 r/min，离心25 min，制得空白血浆溶液，取空白溶液、阿魏酸对照品、样品溶液、空白血浆、空白血浆+阿魏酸对照品、空白血浆+样品溶液20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样，发现阿魏酸峰型良好，互相之间无杂质干扰(图1)，表明该试验方法专属性较好。

a：空白溶液；b：阿魏酸对照溶液；c：舒脑欣滴丸样品溶液；d：空白血浆溶液；e：血浆+阿魏酸标准品；f：血浆+舒脑欣滴丸样品溶液

2.3.2标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.25、0.5、1.5、3、5 mL，分别放置于10 mL的容量瓶中，各加甲醇稀释至刻度，即得含量为5 、10、30、60、100 μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录各峰面积，以对照品溶液浓度对峰面积进行线性回归，得到回归方程为Y=2000000X+753307，r=0.9998，结果表明，阿魏酸溶液浓度在5～100 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.3精密度试验 精密吸取上述对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积值，计算RSD为1.29%，表明仪器的精密度良好。

2.3.4稳定性试验 取“2.2.2”项下舒脑欣滴丸样品溶液室温放置，分别于0、2、4、8、12 h按“2.1”项下色谱条件下进样测定，结果测得阿魏酸峰面积RSD值为1.09%，小于2.00%，表明舒脑欣滴丸样品溶液在12 h内稳定；取“2.2.5”项下50、10、5 μg·mL-1人血清白蛋白对照品溶液室温放置于2、4、6、8、12 h，分别吸取0.5 mL，置于超滤管中，于4℃，10000 r/min，离心25 min，得到不同质量浓度的超滤液，按上述色谱条件进样分析，结果测定阿魏酸的峰面积RSD均不超过5%，表明人血清白蛋白样品室温12 h稳定。

2.3.5加样回收率试验 分别称取舒脑欣滴丸5粒，6份，按上述样品溶液处理方法制备成供试品溶液6份，各加入阿魏酸储备液(200 μg·mL-1)0.5 mL，按“2.1”项下色谱条件下进样测定，计算阿魏酸平均回收率为97.34%，RSD为1.00%，说明本方法回收率良好。

2.3.6超滤膜回收率考察试验 取阿魏酸对照品储备液适量，稀释成浓度为6、10、30 μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液；分别吸取上述稀释后阿魏酸对照品溶液各0.5 mL，置于超滤管内，在4℃下，10000 r/min，离心25 min，即得三种不同质量浓度的阿魏酸对照品的超滤液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，计算阿魏酸的浓度，结果求得超滤膜回收率均大于95%，RSD均小于3%，表明超滤膜对阿魏酸无特异性吸附。

2.4 样品含量测定

取舒脑欣滴丸药品5粒，精密称重，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液3份，在上述色谱条件测定， 计算舒脑欣滴丸中阿魏酸的含量，得出阿魏酸的平均含量为161.02 μg/丸，RSD<1%。

2.5 蛋白结合率试验

精密量取舒脑欣滴丸样品溶液(80.51 μg·mL-1)100 μL，3份，分别置于1.5 mL的离心管中，分别加入900 μL的人血清白蛋白溶液，涡旋1 min混匀，制备成舒脑欣滴丸血清白蛋白样品溶液。将上述舒脑欣滴丸血清白蛋白溶液于37℃下水浴100 min，吸取0.5 mL置于超滤管中，在4℃，10000 r/min离心25 min，取其超滤液按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录阿魏酸峰面积，计算舒脑欣滴丸中阿魏酸的血浆蛋白结合率为(20.92±1.33)%，计算公式如下：血浆蛋白结合率=(ρ超滤前-ρ超滤液)/ρ超滤前×100%，式中：ρ超滤前为超滤前舒脑欣滴丸中阿魏酸的质量浓度，ρ超滤液为舒脑欣滴丸超滤液中阿魏酸的质量浓度。

3 讨 论

实验对舒脑欣滴丸中阿魏酸的提取溶剂、超声时间、溶剂浓度进行了筛选，分别考察了50%、70%、90%甲醇和乙醇超声提取，超声时间20 min、40 min、60 min，结果70%甲醇超声提取40 min为最佳提取条件。

血液中的游离型药物是产生药理作用的部分，也唯有游离的药物才能被生物转化或肾脏排泄，药物与蛋白的结合会影响药物的作用持续时间。通常与药物结合的血浆蛋白主要是白蛋白、脂蛋白及α1-酸性糖蛋白，因为白蛋白的含量最高，因此选择人血清白蛋白进行研究。研究药物血浆蛋白结合率的方法有很多，传统的方法如超滤法、平衡透析法、微透析法和凝胶过滤法等[8]，其中平衡透析法和超滤法比较常用，但是平衡透析法耗时比较长，透析袋可能存在特异性吸附，使测定的药物蛋白结合率产生较大的误差。而超滤法设备简单、操作方便、分离速度快，并且样品用量少，避免药品的浪费，因此本实验采用超滤法测定舒脑欣滴丸中阿魏酸的血浆蛋白结合率[9]。

本次试验对离心时间和离心转速及温育时间进行了考察。分别以5000、8000、10000 r/min的转速下分别离心15、25、30 min时，按上述色谱条件进样测定，计算阿魏酸浓度变化情况，超滤管中超滤液体积的变化情况，根据不漏蛋白，并且超滤液体积与总体积之比在0.3到0.6之间的标准[9]，确定超滤条件为10000 r/min，25 min。温育时间的长短直接影响药物的血浆蛋白结合率，时间过短则药物与蛋白的结合不完全。考察温育时间时，模拟人体温度，分别将阿魏酸与人血清白蛋白温育30、60、80、100、120、150 min，取出处理进样测定，发现100 min后阿魏酸浓度几乎不发生变化，说明阿魏酸与人血清白蛋白结合已经达到平衡，所以温育时间为100 min。