荠菜TPD1基因启动子与GUS基因表达载体的构建及拟南芥遗传转化

何金花，杨正修，姜路华，方 磊，赵 燕

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

植物花器官发育是植物生长周期的重要过程，也是发育生物学研究引人注目的事件。从最早提出的花器官发育ABC模型，逐步扩展到ABCD模型、ABCDE模型。目前，关于花器官的发生和发育相关的基因调控网络已经积累了大量的信息，发现并克隆了一系列有关控制花器官分化和发育的基因。如控制拟南芥中花瓣、雄蕊、心皮、胚珠发育所必需的STK、SHP、SEP、AP1、AP3、AG、P1、LFY等基因［1-5］。其中与雌蕊发育相关的基因包括 AGAMOUS（AG）、CRABSCLAW（CRC）、SEUSS（SEU）、SPATULA（SPT）、STYLISH1（STY1）等［6］。拟南芥心皮发育主要受CRC、SPT、AG基因的控制，这3个基因相互关联并发生作用［7］，三者属于MADS-box［8-9］中的成员。Yang等在研究花粉不育的过程中克隆了拟南芥TAPETUM DETERMINANT（TPD1）基因，TPD1编码1个含176个氨基酸的小蛋白与EMS1基因编码的1个LRR-RLK（富亮氨酸）蛋白受体激酶［10-11］共同作用，参与花粉形成的调控机制［12］，TPD1主要是在小孢子母细胞中表达，其突变体tpd1在花药细胞层出现发育缺陷，突变体的绒毡层细胞被额外形成的小孢子母细胞所取代。Yang等通过进一步研究，构建了35S：：TPD1过表达载体在拟南芥的心皮中进行异位表达，结果显示，拟南芥长果角的心皮形态变宽变短了［13］。Huang等证实了AtTPD1基因在胚珠中的表达［14］，AtTPD1的异位表达可引起胚珠和种子发育中的多效缺陷，如改变胚珠发育期间生长素信号基因和核心细胞周期基因的表达，使细胞周期蛋白基因CYCD3和CYCA2在胚珠中的表达水平增高，一旦CYCD3表达模式受到影响，细胞周期则会发生紊乱，致使心皮细胞横向分裂能力增强最终导致心皮变宽［15］。

拟南芥和荠菜同为十字花科植物，二者在遗传背景、生理特性上有着较多的相似性，但其心皮形态差异显著，拟南芥为二心皮发育成的柱形长角果，而荠菜则为二心皮心型短角果，说明两者的同源基因在表达部位和表达模式上存在差异。为探讨荠菜CbTPD1基因在心皮形态建成中的作用，本研究构建TPD1基因启动子的GUS融合表达载体，转化拟南芥，以期为探讨TPD1基因在拟南芥和荠菜雌蕊（心皮）形态建成过程中表达模式的差异提供重要的生物学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拟南芥（Arabidopsis thaliana）为Columbia生态型，荠菜（Capsella bursa-pastori）为野生型，均采集于湖南农业大学耘园实习基地；根癌农杆菌（Agrobacterium tumefactions）GV3101、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、载 体pCAMBIA1301均由湖南农业大学生物科学技术学院细胞生物学研究室提供。

1.2 植物培养条件

用0.1%氯化汞对拟南芥种子进行表面消毒8 min，于超净工作台上用无菌水漂洗8～10次，以适当密度播种于含10%蔗糖的1/2MS固体培养基上，避光，在4℃条件下春化3 d，转入光照培养室（光周期昼/夜为16 h/8 h，22℃恒温，50%恒湿）培养。待其长至14 d时，转入盛有浸透营养液的人工土壤（腐殖土、蛭石、珍珠岩体积比为3∶1∶1）中，盖上透明塑料薄膜培养2 d，生长条件同上。

1.3 pCA1301-CbTPD1pro::GUSWTBZ表达载体的构建及遗传转化

1.3.1 CbTPD1基因启动子片段的克隆 根据GenBank公布的红花荠菜TPD1基因序列推导出上游启动子区域序列，利用DNAUSERchs软件，分析CbTPD1pro启动子序列的酶切位点。采用DNAMAN设计扩增引物CbTPD1pro-UP和CbTPD1pro-DN，在引物的5′端分别引入SmaⅠ和NcoⅠ酶切位点，CbTPD1pro-UP：TCCCCCGGGCTCGTGTGATTCTGATTAC TCTCT；CbTDP1pro-DN：CATGCCATGGGTGGTTAGACGTCGGG AAACT，以荠菜总DNA为模板进行PCR（预变性95℃，7 min；变性94℃，40 s；退火68℃，40 s；延伸72℃，100 s；终末延伸72℃，7 min；共30个循环）扩增，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化目的片段。

1.3.2 pCA1301-CbTPD1pro：：GUS载体构建及工程农杆菌的制备 用SmaⅠ和NcoⅠ限制性内切酶在37℃条件下过夜双酶切pCAMBIA1301载体和目的片段，将得到的目的片段和目的载体进行回收。用T4连接酶将CbTPD1基因启动子连接至pCAMBIA1301载体的预期位点。通过热激法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定并送华大基因测序以证实重组质粒的正确性，并将测序得到的荠菜CbTPD1基因启动子序列与拟南芥AtTPD1基因启动子进行元件的对比分析。

挑选测序正确的重组质粒通过电击法转化根癌农杆菌GV3101，将转化液置于YEB固体培养基（内含50 mg/mL利福 平+50 mg/mL庆大霉素+50 mg/mL卡那霉素）上，28℃黑暗过夜培养，挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定并进行扩大培养，用于植物的转化。

1.4 拟南芥的遗传转化及转基因植株的鉴定

采用浸花序法转化Columbia生态型拟南芥。收获T0代种子播种于含潮霉素（30 mg/L）的1/2MS固体培养基上，在植物生长室培养2周左右将抗性植株移栽至人工土壤中正常生长，为检测目的片段是否已经整合到转化受体的基因组中，当植株长至6～8叶时，以CTAB法提取抗性植株叶片的DNA为模板，设计GUS基因特异性引物PC-TPD1proUP-CTCGT GTGATTCTGATTACTCTCTPC-GUSDn-CGAAACGCAGCACGA TACGC对转基因植株进行PCR检测，以Columbia生态型拟南芥为对照，鉴定转基因植株。

1.5 转基因植株的GUS组织化学染色及显微观察

取拟南芥转基因植株的幼苗及花序等置于GUS染液中进行抽真空，直至材料组织沉入染液底部。置于37℃恒温箱避光染色12 h左右，脱色后将染色组织置于奥林巴斯SZX10体式显微镜下观察染色结果并拍照。

2 结果与分析

2.1 CbTPD1启动子的克隆

根据GenBank公布的红花荠菜TPD1基因序列推导出上游启动子区域序列，设计扩增引物，以荠菜总DNA为PCR模板进行同源克隆，扩增出与预期大小1 561 bp相符的目的片段（图1），经测序比对与预期一致，说明成功克隆了荠菜CbTPD1pro的启动子序列。

2.2 pCA1301-CbTPD1pro::GUS载体的构建

对克隆至T载体上的CbTPD1pro片段的重组质粒pMD18-CbTPD1pro和植物表达Ti质粒载体pCAMBIA1301用SmaⅠ和NcoⅠ分别进行双酶切，纯化酶切产物，进行连接反应，构建pCA1301-CbTPD1pro：：GUS融合表达载体（图2）。将连接产物热激转化到大肠杆菌，然后从大肠杆菌中DH5α提取该重组载体，再转化到农杆菌感受态GV3101中，GV3101菌落PCR检测（图3）和酶切鉴定（图4），与预期的CbTPD1pro 1 600 bp左右大小相符，说明 pCA1301-CbTPD1pro：：GUS报告载体构建成功。

2.3 CbTPD1基因启动子测序与启动子元件分析

通过PlantCARE启动子在线分析软件，对荠菜CbTPD1（图5）、拟南芥AtTPD1基因启动子元件的比较分析（表1）发现，二者均具有植物启动子最基本的高转录水平调控因子、光响应元件、茉莉酸酯、赤霉素响应等元件。但二者的逆境胁迫响应元件存在较大差异，如CbTPD1pro缺乏水杨酸响应顺式作用元件，赤霉素与茉莉酸酯响应元件也与AtTPD1pro有差异，CbTPD1pro元件中包含了参与玉米素代谢途径，以及在胚乳表达的顺式作用元件，而AtTPD1pro元件中却没有。其主要差异体现在胚乳表达元件、光响应元件以及对赤霉素、水杨酸的响应等方面。

2.4 拟南芥遗传转化及筛选

将成功转入农杆菌的重组载体，通过浸花法转化Columbia生态型拟南芥。收获T0代种子平铺于筛选培养基（1/2 MS+3%蔗糖+7%琼脂+30 mg/mL潮霉素）上，7 d左右种子均可萌发。在植物生长室培养2周后可观察到，非转基因的拟南芥幼苗中由于没有潮霉素抗性基因的表达，其根与真叶的分化受到抑制，叶片卷曲、植株无根，而后慢慢黄化萎蔫；成功转入重组载体的拟南芥幼苗则正常生根，分化真叶，可以长出莲座叶（图6中黑色箭头所示）。

2.5 转基因植株的鉴定

将抗性苗移栽至营养钵，待生长健壮后取单株叶片提取DNA作模板，用检测引物PC-TPD1proUP/PC-GUSDn进行PCR分子检测。由图7可知，1号泳道为野生型阴性对照，2号泳道为质粒阳性对照，3～12号泳道为转基因阳性植株的分子检测，其中除4号、8号、12号泳道检测未获得目的条带，其余均可扩增出预期大小为1 561 bp的目的条带，即为转基因植株。PCR扩增结果表明，外源目的基因已整合进植株基因组中。

2.6 转基因植株的GUS组织化学染色及显微观察

将转基因拟南芥T1代种子平铺于筛选培养基（1/2 MS+3%蔗糖+7%琼脂+30 mg/mL潮霉素）上，置于光照培养室生长7 d后对幼苗进行GUS染色检测，14 d左右移栽至营养钵继续生长，对其花序进行GUS染色检测，通过实体显微镜观察。其染色结果（图8、图9）显示，转基因拟南芥幼苗中，荠菜CbTPD1pro：：GUS在幼苗期子叶、真叶、根、根毛等部位均可见明显的GUS着色，表明荠菜CbTPD1启动子驱动的GUS报告基因在拟南芥幼苗各部位均有高水平的表达（图8-A、图8-B为转35S：：GUS阳性对照）。花序中花器的果荚柄、花丝、蜜腺、柱头及花瓣的维管束等部位均检测到明显的GUS活性（图8-E、图8-F、图8-G、图8-H），但在花药中却没有GUS活性的表达（图8-F），这与实验室前期AtTPD1在拟南芥花药中的过表达结果不同，拟南芥AtTPD1在花药中表达明显（图9-A、图9-B）。从花器发育的几个时期取材进行GUS染色的结果分析发现，CbTPD1pro：：GUS在花序幼嫩的花蕾期几乎不表达（图8-C、图8-E）。当花器发育至第8至第9期左右时，CbTPD1基因可在雌蕊的柱头表达，随后开始在花托、花萼、蜜腺等部位表达，其中在第12、第13期左右其表达量达到峰值，在后续心皮发育过程中，心皮的顶部及基部始终具有较高水平的表达（图8-C、图8-E、图8-F、图8-G，图8-D为野生型花序对照）。其GUS基因在荠菜花器官中的表达活性和组织定位，为后续研究CbTDP1基因在荠菜、拟南芥心皮发育过程中的不同表达模式提供了有价值的依据。

表1 荠菜与拟南芥TPD1启动子元件分析比对

3 讨论

本研究以pCAMBIA1301为出发质粒构建了荠菜CbTPD1基因启动子的GUS融合表达载体，并通过转化Columbia生态型拟南芥获得了稳定遗传的转基因植株，为进一步研究CbTPD1基因的表达特征提供了可靠的材料。现有研究表明，AtTPD1在绒毡层发育时期主要是在生殖细胞中表达，它的突变影响绒毡层细胞的分化发育，使花药细胞层出现发育缺陷，其绒毡层细胞被额外形成的小孢子母细胞所取代［16］，TPD1可通过与EMS1互作参与花粉形成的调控并可在心皮进行异位表达，参与心皮形态建成。有意思的是，本研究将荠菜CbTPD1启动子驱动的GUS基因转化拟南芥后发现，荠菜CbTPD1却不在拟南芥的花药（雄蕊）中表达，这与Yang等报道的拟南芥AtTPD1参与绒毡层的形成及小孢子母细胞的发育等研究结果［13］不同，这暗示了CbTDP1基因可能不参与绒毡层和小孢子母细胞的发育，而是特异性地在心皮中表达并影响和促进其最终发育成短角果，或在参与花粉发育调控网络的位置上与拟南芥有所差异，TDP1基因在荠菜、拟南芥心皮发育过程中的不同表达模式，影响整个心皮发育的基因调控网络而导致了两者心皮形态的差异。但植物心皮形态发育过程受多种基因调控，这些基因协同参与心皮形态的建成，除主效基因直接参与调控心皮发育外，生长素的极性运输和浓度分布都对雌蕊顶端发育及心皮的形态建成具有重要作用。本研究通过对荠菜CbTPD1启动子在拟南芥中的GUS染色定位分析为深入研究该基因对心皮形态建成的影响奠定了研究基础。