磁性石墨烯/β-环糊精复合材料固相萃取-HPLC-MS/MS法检测饲料中的6种镇静剂和5种β-受体激动剂

何晓明，余鹏飞，陈 可，赵月钧，沈雄雅，胡永东，倪娟桢

（绿城农科检测技术有限公司，浙江杭州31052）

随着养殖业的快速发展，镇静剂和β-受体激动剂作为促生长剂被广泛用于动物养殖过程中。镇静剂是一类对中枢神经系统具有抑制作用的药物，具有抗惊厥、镇静催眠、抗焦虑、肌肉松弛和安定作用，在饲养过程中将此类药物添加至饲料中以达到快速催肥、缩短出栏时间的目的［1］。β-受体激动剂，俗称“瘦肉精”，可以选择性地作用于肾上腺素，增加蛋白质合成、增强脂肪分解代谢，显著提高酮体瘦肉率［2］。研究表明，镇静剂和β-受体激动剂可通过饲料进入到动物组织，长期食用会对人体中枢神经系统等造成不良影响［3-4］。我国原农业部176号、193号公告中明确规定严禁在动物饲养过程中使用该类药物。因此，建立一种快速、高效、灵敏、准确地检测饲料中多种镇静剂和β-受体激动剂的方法，对保障畜产品的质量安全具有重要意义。

迄今为止，镇静剂和β-受体激动剂的检测方法主要包括：酶联免疫法（ELISA）［5］、气相色谱-质谱法（GCMS）［6-7］、液相色谱法（HPLC）［8］和高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）［9-10］。ELISA法和HPLC法方法灵敏度较低，选择性较差，不能满足痕量检测的要求。GC-MS法通常需要衍生化才能进行测定，费时较长。HPLC-MS/MS法因其具有灵敏度高、选择性和抗干扰能力强，成为最常用的检测方法。

由于镇静剂和β-受体激动剂在饲料中一般以痕量存在，且饲料基质复杂，易对分析造成干扰，在进行检测分析前需进行富集和净化。目前，饲料样品残留的前处理方法主要是固相萃取技术（SPE），存在如操作繁琐、处理时间长、成本高等问题。相比之下，基于磁性石墨烯的磁性固相萃取技术因结合了磁性萃取操作简单、传质迅速、材料可回收利用和石墨烯具有巨大的比表面积和对有机化合物产生强大的π-π相互作用等特点，目前已被应用于多个领域［11-13］。然而，石墨烯作为一种疏水性的碳基纳米材料，在萃取过程中容易团聚，极大地阻碍了其在前处理技术中的应用。

β-环糊精（β-CD）是由7个D-（+）吡喃葡萄糖通过α-1，4糖苷键首尾相连而成环形低聚糖，具有一个环外亲水的疏水腔，能够选择性吸附各类客体分子在疏水空腔内形成稳定的主客体络合物。利用β-环糊精修饰磁性石墨烯制备纳米复合材料，保留了磁性石墨烯和β-环糊精两者的自身优点，也可以增加石墨烯的亲水性和分散性，避免石墨烯由于π-π 作用和范德华力作用而团聚的现象，提高萃取效率［14-17］。

本研究利用改进的磁固相萃取对饲料进行前处理，自制了一种新型的吸附剂（Fe3O4-G/β-CD）对饲料中的6种镇静剂和5种β-受体激动剂进行萃取，同时结合HPLC-MS/MS对其进行测定。本方法具有较高的灵敏度及精密度、较短的实验时间、较低的分析成本等特点，能满足目前的检测要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-MS/MS 8050三重四级杆液相色谱-串联质谱仪（日本Shimadzu公司）；ST16R高速冷冻离心机（美国Thermo公司）；DZF-0632真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

β-受体激动剂类：克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、西马特罗、特布他林；镇静剂类：氯丙嗪、地西泮、艾司唑仑、咪达唑仑、奥沙西泮、硝西泮纯度均大于95%，购于 Dr.Ehrenstorfer公司。

磁性石墨烯Fe3O4-G（笔者所在实验室自制［17］）；甲酸、乙腈和甲醇（HPLC级，美国Thermo公司）；实验用水为Milli-Q（美国Millipore公司）超纯水；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 标准储备液的配制

分别准确称取10 mg上述标准物质，采用甲醇配制成浓度为100 mg/L的储备液，置于-18℃冰箱保存，分别吸取100μL配制好的标准溶液于10 mL容量瓶中，采用甲醇定容，配制成1 mg/L混合标准溶液，临用时稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.3 磁性石墨烯/β-环糊精复合材料（Fe3O4-G/β-CD）的制备

Fe3O4-G/β-CD参照文献［17］采用原位沉淀法制得。取磁性石墨烯Fe3O4-G 600 mg分散于150 mL水中，超声1 h，加入2.5 mL浓氨水，室温下搅拌10 min，加入4.8 gβ-环糊精，于60℃水浴中搅拌5 h。待溶液冷却至室温，用乙醇和水洗涤数次去除过量的β-环糊精，用磁铁分离，60℃下真空干燥24 h后得到Fe3O4-G/β-CD。

1.4 样品前处理

称取2.0 g均质处理好的饲料样品于50 mL聚乙烯离心管中，加入10 mL 80%乙腈-水溶液，涡旋混匀，超声提取5 min后，4℃下以4 000 r/min离心3 min，取上清液于50 mL鸡心瓶中。残渣用10 mL 80%乙腈-水溶液重复提取1次，合并2次提取液，旋转蒸发至干，用10 mL水复溶，转移至15 mL离心管中。

称取60 mg Fe3O4-G/β-CD加入到上述离心管中，40℃下超声6 min，用磁铁分离固液两相。弃去上清液，加入3 mL乙腈，涡旋2 min，磁性分离后将上清液转移至另一离心管中，重复解析1次，合并收集2次解析液，40℃下氮吹近干。用1.0 mL甲醇复溶，过0.22μm 有机相滤膜，供HPLC-MS/MS测定。

1.5 测定方法

1.5.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8μm）；柱温：40℃；流速：0.3 mL/min；进样量：3μL；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸甲醇溶液；梯度顺序：0～1.0 min，7% B；1.0～3.0 min，7%～25% B；3.0～5.0 min，25%～95% B；5.0～7.0 min，95% B；7.0～8.0 min，95%～7% B。

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）：正离子模式；温度：400℃，毛细管电压：4 000 V；雾化气流量：3.0 L/min；加热气流量：10.0 L/min；定性与定量离子对、碰撞能量等参数见表1。

表1 11种待测物的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱及质谱条件优化

根据待测物特点，本研究选用ESI正离子模式作为其离子化方式。分别配制质量浓度为200μg/L的标准溶液，采用一级质谱全扫描的方式获得各待测物的准分子离子，再对其进行二级质谱分析，确定每个待测物的定量、定性离子对，最后在多反应监测模式下进一步优化各种质谱参数。所选择的母离子、子离子和碰撞能量等参数见表1。

本研究考察了ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.8μm）、Ultimate UHPLC AQ-C18（2.1×100 mm，1.8μm）和Kinetex@2.6μm XB-C18（2.1×100 mm，2.6μm）3种不同类型的色谱柱对11种待测物的灵敏度和分离效果。结果表明，3种色谱柱的灵敏度均能满足要求，但采用ACQUITY UPLC HSS T3柱时，待测物谱峰峰形较好，因此选用ACQUITY UPLC HSST3色谱柱。

ESI电离是在溶液状态下完成的，因此本研究进一步对流动相进行优化。文献表明，使用甲醇或在水相中添加0.1% 甲酸均能使待测物获得较好的分离度和响应强度［9-10］。本研究在此基础上考察了在甲醇中加入0.1%甲酸对11种待测物分离及峰型的影响。结果表明，当甲醇中加入0.1%甲酸后，虽对待测物响应强度影响不大，但峰型和重复性有明显改善。这可能是甲醇和水相中酸浓度相同，保证了在梯度洗脱过程中，2种流动相混合时，pH值恒定，容易平衡梯度。因此本研究选择0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相。11种化合物的总离子流色谱图见图1。

2.2 提取条件优化

文献显示，甲醇、乙酸乙酯和乙腈是兽药提取的的常用试剂，由于饲料中蛋白质和脂类物质是主要的基质干扰物，所以选择了有更好的蛋白沉淀作用的乙腈作为提取试剂。

饲料的水分含量较低，直接用有机溶剂提取效果不佳。为改善提取效果，在提取时加入一定量水用以分散样品，增加有机试剂与样品的接触面积，从而提高提取效率。本研究进一步对体积分数为60%、70%、80%、90%的乙腈-水溶液和纯乙腈5种提取试剂进行比较。结果表明，当提取溶剂中乙腈体积分数为80%时，提取效率最高，通过2次分步提取，11种待测物的回收率均大于85%。

2.3 萃取条件优化

为得到11种待测物的最佳萃取条件，本研究分别考察了吸附剂用量、pH值、萃取温度、萃取时间、洗脱溶剂的种类及用量、洗脱时间等因素对萃取效果的影响。

2.3.1 吸附剂用量 吸附剂的用量是影响萃取效率的重要因素，本研究分别对20、40、60、80、100 mg的Fe3O4-G/β-CD用量进行了考察，由图2-A可知，当Fe3O4-G/β-CD用量为20～60 mg时，萃取效率随Fe3O4-G/β-CD用量的增加而明显提高；继续增加用量萃取效率反而有降低趋势，可能是过多的Fe3O4-G/β-CD导致待测物洗脱不完全，因此选择吸附剂的用量为60 mg。

2.3.2 pH值 pH值是影响吸附剂和待测物物化性质的重要因素，本研究考察了pH值在2～10时对11种待测物的萃取效率的影响，由图2-B可知，pH值在2～8时，萃取效率随着pH值的增高而增大，这是由于11种待测物均为碱性化合物，酸度系数（pKa）＞7，碱性条件下非离子状态存在，易与吸附剂吸附。pH值继续升高，回收率有所下降，产生这现象的原因可能是活性基团容易在强碱条件下电离，影响了待测物与吸附剂之间的相互作用，因此选择pH值为8。

2.3.3 萃取温度 温度可以改变待测物从样品扩散到吸附剂的传质速率，选择适当的温度有利于待测物的萃取，考察了萃取温度分别为20、30、40、50、60℃时的萃取效果，由图2-C可知，萃取效率随着温度的升高而逐渐增加，在40℃时萃取效率达到最大；温度继续升高萃取效率反而有所下降，可能是随着温度升高待测物在吸附剂和样品间分配系数降低的原因，因此最终选择萃取温度为40℃。

2.3.4 萃取时间 固相萃取本质是待测物在提取试剂与吸附剂之间达到一个分配平衡，萃取效率与萃取时间有着直接的关系。选择适当的萃取时间不仅能提高萃取效果，还可以缩短萃取时间。本研究对萃取时间为2、4、6、8、10 min时的萃取效率进行比较，由图2-D可知，随着萃取时间的延长，萃取效率逐渐增大，当萃取时间达到6 min后萃取效率基本稳定，吸附已经饱和，达到萃取动态平衡。因此本研究选择萃取时间为6 min。

2.3.5 洗脱溶剂的种类及体积 洗脱溶剂的种类是影响洗脱效率的重要因素，为了将待测物尽可能地从Fe3O4-G/β-CD中洗脱，本研究察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和三氯甲烷4种试剂的洗脱效果，由图2-E可知，采用乙腈作为洗脱溶剂时对11种待测物的洗脱效率最好，因此选择乙腈作为洗脱溶剂。进一步考察了洗脱溶剂用量1、2、3、4、5 mL对洗脱效率的影响，由图2-F可知，当洗脱溶剂用量为3 mL时，11种待测物的回收率均大于85%，继续增加洗脱溶剂用量，回收率无明显变化，因此选择3 mL乙腈作为洗脱溶剂。

2.3.6 洗脱时间 洗脱时间也是影响洗脱效率的一个重要因素，为更高效地将待测物从Fe3O4-G/β-CD中洗脱，考察洗脱时间1、2、3、4、5 min时的洗脱效果，由图2-G可知，2 min就足以完全洗脱待测物。因此，选择洗脱时间为2 min。

2.3.7 Fe3O4-G/β-CD的重复利用 为考察Fe3O4-G/β-CD的重复利用性能，每次试验后，采用乙腈洗涤3次，60℃烘干，再重新按“1.5”节进行处理。结果显示，当循环使用5次后，待测物的回收率仍在80%以上，说明Fe3O4-G/β-CD具有良好的稳定性和较高的重复利用率。

2.4 基质效应

基质效应在液相色谱-串联质谱分析中普遍存在，是基质成分和待测物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争所致。为评价基质效应，分别配制基质匹配标准曲线（添加含量为1、5、10、20、50、100μg/L）及对应的纯溶剂标准曲线。根据基质标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率比值评价11种待测物的基质效应。若斜率在0.8～1.2之间，表明基质效应不明显。结果表明，11种待测物斜率在0.833～0.905之间，说明本研究的前处理方法可以有效消除饲料中蛋白质和脂类物质等引起的基质效应。但为了获得更加准确的定量结果，本研究仍采用基质匹配标准曲线以消除基质效应的影响。

2.5 线性范围和定量限

配制6个水平的基质匹配混合标准溶液进行测定，以色谱峰面积为纵坐标（Y），相应的质量浓度（μg/L）为横坐标（X）绘制标准曲线，得出11种待测物线性范围、线性回归方程和相关系数（表2）。同时，根据10倍信噪比（S/N）确定待测物方法定量限（LOQ），表明11种待测物的线性关系良好，定量限为μg/kg数量级。

表2 11种待测物的线性方程、回归方程、相关系数和定量限

2.6 回收率与精密度

在空白配合饲料、浓缩饲料和预混饲料中分别添加5、10、25μg/kg 3个水平的混合标准溶液，按照“1.4”节和“1.5”节前处理方法及测定条件重复测定6次。由表3可知，11种待测物平均回收率为84.7%～96.8%，相对标准偏差为3.2%～10.8%，说明该方法具有较高的准确度和精密度。

与现行国家标准［18-19］和文献［9-10］相比，本方法在保证灵敏度的前提下，操作更加简便，同时将检测周期缩短至1 h，更适合大批量样品的检测。

2.7 实际样品分析

用本方法对日常送检的配合饲料、浓缩饲料和预混饲料各10份进行分析，均无药物残留检出。

3 结论

本研究以自制的β-环糊精磁性石墨烯纳米材料为新型吸附剂，采用磁固相萃取技术，并结合HPLC-MS/MS建立了可同时测定饲料中6种镇静剂和5种β-受体激动剂的快速检测方法。结果表明，该方法具有简便、快速、准确度好、灵敏度高、经济的特点，且有效克服了基质干扰的问题，可以满足日常饲料样品快速检测的需求，为监管部门提供技术支撑。

表3 空白样品中11种待测物的回收率和相对标准偏差（n＝6）