抗黄萎病转基因棉花对灰巴蜗牛（Bradybaena ravida）的影响

方志翔，张 莉，沈文静，郭汝清，刘 标

（生态环境部南京环境科学研究所/国家环境保护生物安全重点实验室，江苏南京 210042）

软体动物是动物界中种类繁多的一个分支，已知种类有13万多种［1］。由于分布地域广泛并且物种极其丰富，软体动物在全球陆地和水生生态系统中都扮演了重要的角色。在指示生物和生物监测领域，软体动物可以被成功地用来获取陆地、海洋和淡水生态系统的环境质量信息［2］。就目前研究来看，软体动物中的腹足纲最多地应用于环境监测这一领域。腹足纲代表着唯一一类分布在陆地生态系统的软体动物。大部分陆栖腹足纲属于肺亚螺纲，只有少数种类属于前腮亚纲。蜗牛泛指腹足纲的陆生所有种类，生活于灌木丛、矮草丛、农田及住宅附近阴暗潮湿地区，世界各地均有分布。在过去的20年间，人们对利用以蜗牛为代表的腹足纲土壤动物进行生物监测展现出越来越浓厚的兴趣，并且开展了一系列卓有成效的研究［3-7］。

近年来，转基因植物在全球范围内种植规模不断扩大，但是关于其生态环境安全性的争议一直存在，大量的物种被用来对转基因植物的环境生态安全性进行评价［8］。蜗牛作为一种食谱广泛的植食性生物，很容易在自然条件下直接或间接食用或接触转基因植物。目前不论野生状态下的蜗牛还是人工饲养条件下的蜗牛，其食物来源大多都是植物。另外，蜗牛一部分生活时间在植物根部土壤中，会接触土壤。而目前有文献报道，转基因作物的外源蛋白会随着根系分泌物或者残体降解而残留于土壤中，并持续较长时间［9-11］。所以，评价转基因植物对蜗牛的影响，对于研究转基因植物对非靶标生物影响以及对自然生态环境影响是十分必要的。国外有学者研究过转Bt基因作物对蜗牛的影响，也有使用纯化Bt蛋白对蜗牛进行毒理试验，但试验结论也是各执一词褒贬不一［12-16］。

本研究以在我国农田广泛存在的灰巴蜗牛（Bradybaena ravida）为研究对象，分别采取了棉叶直接喂饲法和人工饲料添加棉叶法在室内进行了灰巴蜗牛的饲养，研究了抗黄萎病转基因棉花对其的影响。后一种方法避免了现有普通饲养方法易受季节影响，在秋冬季缺少植物鲜活组织从而影响试验，尤其是长期试验进行的弊端，为室内长期蜗牛饲养试验打下了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用蜗牛于2017年6月采集自南京市六合区菜地中，共50只，经鉴定为灰巴蜗牛。

抗黄萎病转基因棉花JA1由江苏省农业科学院提供，抗黄萎病基因Gbvdr2来源于海岛棉品种海7124，亲本棉花（CK）为陆地棉品种泗棉3号。

1.2 试验设计

1.2.1 饲养条件 本研究于2017年6—10月在环境保护生物安全重点实验室内进行。将野外采集的蜗牛置于饲养盒中，底部铺5～10 cm的人造土壤，其成分包括40%黄沙、20%泥炭土、40%高岭土，混合均匀后采取湿热灭菌法灭菌，冷却后调节pH值为5～7，湿度40%左右，以纱布罩住盒口，置于人工气候箱中，保持温度在25～30℃，空气相对湿度保持85%左右，光/暗周期12 h/12 h。投放无农残的有机青菜叶、空心菜叶预喂饲蜗牛备用。

1.2.2 饲养饲料 喂饲试验分为棉叶直接喂饲和人工饲料添加棉叶粉末喂饲2种。

1.2.2.1 棉叶 采集自抗黄萎病转基因棉花JA1及其亲本泗棉3号，定期采集鲜嫩足量棉叶喂饲蜗牛。

1.2.2.2 人工饲料 人工饲料配方：每份人工饲料包括玉米粉100 g、大豆粉100 g、小麦粉100 g、酵母粉50 g、磷酸氢钙30 g、蔗糖20 g、复合维生素（烟酰胺1.0 g、硫胺素0.25 g、核黄素0.50 g、吡哆素0.25 g、钴胺素0.02 g、叶酸0.25 g、泛酸钙1.0 g、生物素0.02 g），体积分数40%的甲醛1 mL，加水600 mL。搅拌混匀后湿热灭菌，冷却凝固后切成片状置于小的培养皿中，将培养皿置入土里，略微露出边沿。

按照试验需要，在上述人工饲料中添加不同剂量的经超低温冷冻研磨粉碎后的转基因植物组织粉末，对照组添加亲本植物组织粉末，喂饲蜗牛。

1.3 试验方法

1.3.1 蜗牛短期喂饲棉叶死亡率试验 以抗黄萎病转基因棉花JA1及其亲本棉花幼嫩茎叶喂饲蜗牛，阳性对照组喂饲涂抹四聚乙醛的菜叶（1 g/g菜叶），每组设3只贝壳螺旋数接近、大小质量近似的蜗牛，持续喂饲72 h，分别在24、48、72 h监测蜗牛的死亡率。

1.3.2 蜗牛取食率试验 测定蜗牛取食棉叶的效率，挑选贝壳螺旋数接近、大小质量近似的单只蜗牛放入培养瓶，将不同的棉花叶片打成直径3 cm的圆片，每个培养瓶中放置1种棉花叶片1张，2组处理各设3次重复，记录24 h内的取食率。

1.3.3 蜗牛短期喂饲人工饲料试验 以抗黄萎病转基因棉花JA1及其亲本棉花茎叶经超低温冷冻研磨后加入饲料喂饲蜗牛，1 kg饲料中混入棉花茎叶组织细粉100 g和200 g，阳性对照组喂饲加入四聚乙醛的饲料。每组设3只螺旋数一致、大小质量接近的蜗牛，持续喂饲72 h，分别在24、48、72 h监测蜗牛的死亡率。

1.3.4 蜗牛长期喂饲人工饲料试验 以抗黄萎病转基因棉花JA1及其亲本棉花喂饲蜗牛，1 kg饲料中混入棉花茎叶组织细粉200 g，每组设3只质量接近的幼贝（3螺层），分别称量其体质量并记录，持续喂饲70 d，期间每14 d监测1次体质量。

1.3.5 蜗牛人工饲料取食率试验 以抗黄萎病转基因棉花JA1及其亲本棉花喂饲蜗牛，1 kg饲料中混入棉花茎叶组织细粉200 g，每组设3只螺层、质量接近的成贝（5螺层以上）作为重复，每次喂饲前后对饲料进行称量，计算24 h内蜗牛的取食量。

1.3.6 蜗牛SOD酶活4号测定 在棉叶短期喂饲试验结束后，取蜗牛去壳匀浆，使用SOD酶检测试剂盒（南京建成生物公司）检测其体内SOD酶活性。

1.4 数据处理

使用MS Excel 2010软件进行数据的处理和作图，用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析Oneway ANOVA和最小显著差异法（LSD，α＝0.05）比较不同处理间差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 蜗牛短期喂饲叶片死亡率

喂饲不同棉花叶片后的72 h内，不同处理组的死亡率情况见表1。从表1可以看出，在试验开始的24、48、72 h内，喂饲棉花转基因棉花和亲本棉花叶片的蜗牛均未出现死亡情况，而喂饲涂抹四聚乙醛棉叶的蜗牛则全部死亡。

2.2 蜗牛叶片取食率

喂饲不同棉花叶片24 h后，不同处理组的取食率见表2。从表2可以看出，喂饲亲本棉花叶片的蜗牛取食率达53.18%，而喂饲转基因棉花JA1叶片的蜗牛取食率为52.13%，二者对棉花叶片的取食率没有显著性差异。

表1 蜗牛喂饲叶片急性死亡率

表2 蜗牛叶片取食率

2.3 蜗牛短期喂饲人工饲料死亡率

以人工饲料添加棉花茎叶组织粉末喂饲蜗牛，不同时段蜗牛死亡率见表3。添加棉花茎叶组的蜗牛不论转基因组还是亲本组，高剂量组还是低剂量组，在72 h内均未出现死亡情况，喂饲添加四聚乙醛人工饲料组的蜗牛则全部死亡。

表3 蜗牛喂饲人工饲料急性死亡率

2.4 蜗牛长期喂饲人工饲料试验

蜗牛长期喂饲人工饲料体质量变化情况见图1。在喂饲转基因棉花及其亲本棉花叶片饲料的0、14、28、42、56、70 d分别测定蜗牛的体质量，在转基因棉花和亲本棉花处理组之间，其体质量增长趋势一致，同一时间内，不同处理组间差异不显著。

2.5 蜗牛喂饲人工饲料取食量测定

使用添加转基因棉花及其亲本棉花粉末的人工饲料喂饲蜗牛，24 h内的蜗牛取食量结果见图2，在不同处理组之间，取食量并没有显著性差异。

2.6 蜗牛SOD酶活测定

在棉叶短期喂饲试验（72 h）结束后，检测了蜗牛SOD酶活性，结果见图3。在喂饲转基因棉花及其亲本棉花叶片的蜗牛之间，其体内SOD酶活没有显著性差异。

3 结论与讨论

蜗牛是农业上的一种害虫，觅食范围非常广泛，可危害豆科、十字花科和茄科蔬菜，以及棉、麻、甘薯、禾谷类作物，桑树、果树等树木；农地中的蜗牛食用农作物的叶、茎、芽、花和多汁的果实，可造成叶片穿透状孔洞、断苗、伤残果等，并传播作物病害，危害蔬菜、花卉、中药材、果树等多种农作物。另外，部分蜗牛品种因为营养丰富，味道鲜美，或者外型适合观赏而被大量人工养殖带来可观的经济效益。目前，我国棉田野生蜗牛品种以灰巴蜗牛与同型巴蜗牛为主。灰巴蜗牛，柄眼目，巴蜗牛科，广泛分布在我国东北、华北、华东、华南、华中、西南、西北等地区。寄生于黄麻、红麻、苎麻、棉花、豆类、玉米、大麦、小麦、蔬菜、瓜类等危害茎叶造成缺刻，严重时咬断嫩苗，造成缺苗断垄［17-20］。因此，以灰巴蜗牛为代表性研究对象，对于探索转基因棉花对蜗牛的影响有着现实的意义。笔者在野外采集灰巴蜗牛，在实验室对其进行了人工饲养，用于试验。

试验结果表明，直接喂饲转基因棉花叶片的蜗牛与喂饲亲本棉花叶片的蜗牛相比，在进行72 h喂饲后，没有出现死亡现象，并且，二者对棉叶的取食率也没有显著性差异。表明转基因棉花对蜗牛并没有急性毒性效应。另外，为了保证长期饲养试验的进行，笔者还研发了人工饲料添加棉花叶片粉末喂饲蜗牛的新方法，该方法保证了在非棉花生长期对蜗牛的长期饲养。人工饲料喂饲试验结果表明，72 h内，喂饲转基因棉花人工饲料的和亲本棉花人工饲料的处理组均未出现蜗牛死亡现象。喂饲70 d的长期试验结果表明，不同处理组之间蜗牛体质量增长趋势一致，相同时期没有显著性差异。单贝取食人工饲料的质量，在不同处理组间也没有显著性差异。72 h喂饲试验结束后，检测了蜗牛体内的SOD酶活性，转基因棉花组与亲本棉花组之间没有显著性差异。

近年来，转基因植物在世界上的种植规模不断扩大，但争议一直存在。我国政府保持着积极研发、慎重推广的态度，这就要求我们的转基因作物环境安全评价工作一定要全面、长期、深入开展。本研究以我国种植面积最大的转基因植物棉花为评价目标，以数量庞大的软体动物门代表性动物蜗牛为研究对象，进行了安全评价工作，为转基因棉花的环境安全评价增添了新数据。