低温处理下转果聚糖合成酶基因对烟草抗逆相关生理指标的影响

陈真真，周国勤，陈金平，谢旭东

（信阳市农业科学院，河南信阳 464000）

果聚糖不仅是一种渗透调节物质，也是一种重要的贮藏性碳水化合物。果聚糖水解后产生的单糖具有提高液泡溶质浓度、增强植物对多种不良环境抵抗力的功能［1］。大多数植物以蔗糖和淀粉作为储藏物质，以果聚糖作为贮藏性碳水化合物的高等植物大部分分布在温带和寒带地区，比如百合科、禾本科、天门冬科、菊科、桔梗科植物等［2］。当遇到干旱胁迫时，植物体内果聚糖、海藻糖、蔗糖等可溶性糖的积累量通常增多［3］，这些可溶性糖的积累具有降低细胞渗透势、提高植物抗逆性的功能。果聚糖累积增强植物抗寒性的主因是果聚糖分解释放出大量游离果糖，可以降低植物组织中水分的冰点，同时这些游离果糖在液泡中累积，可以充当液泡的低温防护剂及渗透缓冲剂［4-5］。

很多研究表明，果聚糖累积有利于增强植物抗逆性。Frossard等研究发现，黑麦草中果聚糖的合成随土壤中重金属含量的升高而增加，说明果聚糖可以增强黑麦草抗毒害能力［6］。Tognetti等的研究表明，在低温诱导下，冬小麦中抗寒性强品种的果聚糖含量是抗寒性弱品种的3倍左右［7］。Albrecht等研究发现，渍水持续胁迫6 d后，小麦根中果聚糖积累量增加了17倍［8］。Kawakami等研究发现，抗冻性强的小麦品种果聚糖积累量比其他小麦品种多，表明果聚糖的累积可有效提高小麦的抗寒性［9］。

李慧娟等的研究表明，1-SST（蔗糖-1-果糖基转移酶基因）、Ta6-SFT（果聚糖-6-果糖基转移酶基因）和Ta1-FFT（果聚糖-1-果糖基转移酶基因）在烟草中的表达，提高了转基因烟草的抗旱、抗寒和抗低温能力［10-12］。植物在逆境条件下会产生大量活性氧类而危及植物正常的生理活动，而抗氧化酶系统能及时清除植物在正常代谢过程中或逆境胁迫下产生的过多超氧化物自由基，以维持细胞内有益而无害的低水平活性氧，保护植物细胞免遭氧化损伤。抗氧化酶由于能专一地清除生物氧化过程中的超氧化物自由基，因而具有重要的生理调节功能。前人通过对不同材料的研究表明，抗氧化酶的活性水平与植物的抗逆性有非常紧密的联系。但是，关于果聚糖合成酶基因与抗氧化酶系统的关系却鲜有研究。笔者曾用农杆菌浸染法获得了含有簇毛麦6-SFT基因的转基因烟草幼苗，在此基础上，本研究为明确果聚糖酶与抗氧化酶的关系，拟从生理生化角度探讨转果聚糖合成酶基因烟草的抗逆生理机制，为烟草的抗逆性育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转CMM-6-SFT基因烟草，由陕西省植物遗传工程育种重点实验室保存，以非转基因烟草W38作为对照。试验于2016年在西北农林科技大学农学院进行。

1.2 材料的选取

将由无性繁殖获得的大小一致的阳性转基因植株移栽至10 cm×10 cm×8 cm塑料盆中。转基因品种和非转基因品种各移栽5株，待植株长至3～5张真叶时，取处理烟草相同部位叶片（从下往上数第3、4张叶）速冻于液氮中，储存于-80℃冰箱中备用。

1.3 生理生化指标测定

过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法，过氧化氢酶（CAT）活性的测定采用紫外吸收法，超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑法，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250法［13］。每个样本测3次，各指标用3个测定值的平均值表示。

1.4 数据处理与分析

采用Excel软件进行基础数据的输入并作图，采用SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 转基因烟草及对照可溶性蛋白含量的比较

由图1可知，在4℃低温处理下，转CMM-6-SFT基因烟草和对照可溶性蛋白含量比25℃时均有所提高。在25℃下转基因烟草和对照可溶性蛋白含量相差不大。4℃低温下转CMM-6-SFT基因烟草可溶性蛋白含量是25℃下的1.96倍，对照可溶性蛋白含量是25℃下的1.17倍。在4℃低温胁迫下转基因烟草的可溶性蛋白含量与对照存在显著差异。可溶性蛋白与植物的抗寒性密切相关，在低温胁迫处理下转基因烟草可溶性蛋白含量显著提高，由此证明转CMM-6-SFT基因烟草抗寒性明显提高。

2.2 转基因烟草及对照CAT活性的比较

由图2可知，在4℃低温处理下，转CMM-6-SFT基因烟草和对照CAT活性比25℃下均有所提高。在25℃下转基因烟草和对照CAT活性差异显著。4℃低温下转CMM-6-SFT基因烟草CAT活性是25℃下的2.6倍，对照CAT活性是25℃下的2.1倍。在4℃胁迫下转基因烟草的CAT活性与对照存在显著差异。在低温逆境胁迫下，植物体内产生大量的活性氧，形成氧化逆境，由于活性氧的化学性质非常活泼，它所催化的化学反应会对细胞产生严重的伤害，因此活性氧的及时清除对植物抗逆性的提高具有重要的意义，由此说明CMM-6-SFT基因的转入增加了烟草的抗逆性。

2.3 转基因烟草及对照POD活性的比较

由图3可知，在4℃低温处理下，转CMM-6-SFT基因烟草和对照POD活性均较25℃下有所提高。在25℃下转基因烟草和对照POD活性差异显著。4℃低温下转CMM-6-SFT基因烟草POD活性是25℃下的3.24倍，对照POD活性是25℃下的1.67倍。在4℃胁迫下转基因烟草POD活性与对照存在显著差异。POD是植物在低温、干旱和盐渍等逆境胁迫下的保护酶体系之一，在逆境条件下植物体内会产生大量的过氧化氢，从而对植物体产生伤害，而POD可以清除自由基和过氧化物，分解植物体内的过氧化氢，避免细胞膜受到伤害，减轻过氧化氢对植物的伤害，由此说明低温胁迫可导致转CMM-6-SFT基因烟草POD活性增加。

2.4 转基因烟草及对照SOD活性的比较

由图4可知，在4℃低温处理下，转CMM-6-SFT基因烟草和对照SOD活性都较25℃下有所提高。在25℃下转基因烟草和对照SOD活性差异显著。4℃低温下转CMM-6-SFT基因烟草SOD活性是25℃下的3.01倍，对照SOD活性是25℃下的1.57倍。在4℃胁迫下转基因烟草SOD活性与对照存在显著差异。SOD是植物体内抵御氧毒害的重要酶之一，低温胁迫导致烟草产生大量的活性氧，SOD活性的增强使转基因烟草比对照更能及时有效地清除自由基，保护细胞免受活性氧胁迫的伤害。

3 讨论与结论

3.1 果聚糖合成酶基因对可溶性蛋白质含量的影响

细胞内积累的可溶性蛋白质等大分子物质可以有效调节细胞内的渗透势，维持水分平衡，从而提高植物的抗逆性，本研究得出，果聚糖合成酶基因的导入提高了烟草中的可溶性蛋白含量，这为抗逆方面的研究提供了重要的理论依据。别晓敏将抗旱性较强的小麦品种扬麦6号扩增的果聚糖合成酶基因导入烟草中，从而使烟草中可溶性糖含量得到极大的提高［14］；高翔等将6-SFT基因导入烟草中，使得烟草植株表现出较强的抗旱、抗盐和抗低温能力［15］。但到目前为止，还没有果聚糖酶基因与可溶性蛋白质含量关系的相关报道。这可能是因为果聚糖基因的导入，诱导了一些新的蛋白生成或使原有蛋白含量明显增加［16-17］，从而提高烟草的抗逆性。

3.2 果聚糖合成酶基因对CAT活性的影响

过氧化氢酶与抗坏血酸过氧化物酶（AsA-POD）一样，都是清除H2O2的主要酶类，主要存在于植物过氧化物体中，它们的不同之处在于前者不需要还原性底物且具有较高的酶活性效率，但是与H2O2的亲和力较弱，后者需要还原性底物，并对H2O2具有较高的亲和力。Willekens等的研究表明，过氧化氢酶是C3植物中H2O2清除的关键酶，而且是C3植物耐受胁迫所必需的［18］。但也有研究指出，在植物体中，主要清除H2O2的酶类为抗坏血酸过氧化物酶；虽然过氧化氢酶因不需要ATP和电子供体而成为原核生物中重要的H2O2清除剂，但因其具有释放O2、定位于植物过氧化物体中和光敏感性等特点，使其在植物抗氧化胁迫中不占重要地位［19］。但无论如何，过氧化氢酶都与植物体内的H2O2代谢有密切关系，能够减轻H2O2对植物的伤害。本研究中的转基因材料CAT活性都比对照高，由此推测，这些外源基因的导入可以提高植株消除氧自由基伤害的能力，从而减轻细胞膜的损伤，提高烟草的抗逆性。

3.3 果聚糖合成酶基因对POD活性的影响

过氧化物酶具有许多非常重要的生理功能，如参与生长素的降解、木栓质和木质素的合成、活性氧代谢过程和其他物质的氧化过程。除了与植物生长发育和正常代谢相关的结构型POD外，很大一部分POD是诱导表达型，这已被大量的胁迫处理试验和分子水平上的基因调控研究所证实［20］。李伶俐等在对棉花幼铃脱落机制进行研究时推测，棉花即将脱落的幼铃在开花后产生了较多的O-2·，作为应激反应，幼铃中的POD活性得到相应提高［21］。本研究中转基因材料CAT活性比对照高，由此推测外源基因CMM-6-SFT的导入可以提高植株消除氧自由基伤害的能力，从而减轻细胞膜的损伤，提高烟草的抗逆性。

3.4 果聚糖合成酶基因对SOD活性的影响

综上所述，液泡溶质浓度和细胞质膜的稳定性是维持细胞正常生命活动的必要条件，但植物在整个生长发育过程中会受到各种不良环境的影响，导致细胞膜脂的稳定性遭到破坏。植物体内存在过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等保护系统，以应对来自外界的逆境胁迫［29］。一直以来，培养出抗逆性强的植物，是研究者工作的重中之重。本研究将抗逆性较强的簇毛麦6-SFT果聚糖合成酶基因导入烟草中，结果显示，烟草叶片中可溶性蛋白质含量、CAT活性、POD活性、SOD活性都比对照有所提高。由此推断，果聚糖合成酶基因的导入可能会提高烟草的抗逆性。