3种核桃副产物多酚提取液的体外抗氧化活性分析

郑渝川,黄仲华,黄伊嘉,杨 凌,吴 斌

(四川省林业科学研究院，四川 成都 610066)

食品抗氧化剂是指延滞因氧化而引起的食品劣变、酸败或变色的物质。合成抗氧化剂如BHT、BHA和TBHQ长期以来一直垄断着食品抗氧化剂的市场。但人工合成的抗氧化剂具有一定的毒性和致癌作用，因此天然抗氧化剂日益受到人们的重视。天然抗氧化剂大部分从植物中提取，以多酚和黄酮类为主。现已有迷迭香提取物、茶多酚、甘草抗氧化物、竹叶抗氧化物等天然抗氧化剂已经广泛地应用于高脂食品中。天然抗氧化剂除了防止食品氧化，还有利于身体健康，流行病学表明，人类患慢性疾病的风险与摄入多酚含量丰富的食品数量呈显著负相关[1]，能减少心血管疾病和癌症的发病率[2]。因此，以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是食品抗氧化剂发展的趋势，同时寻找更廉价、高效的多酚提取原料也具有极大的意义。

核桃是世界著名的“四大干果”，核桃仁中含有丰富的多酚类物质，不仅对人体起到了积极的抗氧化作用，而且对核桃仁本身防止氧化也起到了很好的保护作用[3]。核桃仁本身具有较高的经济价值，直接提取多酚较浪费，而部分核桃副产物，如核桃青皮、核桃粕、核桃壳等也含有丰富的多酚[4～6]，这部分资源通常当做饲料或丢弃，利用价值较低或得不到利用。现有报道仅研究了单一核桃副产物或单一提取试剂对多酚提取率和抗氧化性的影响，不同提取试剂以及不同核桃副产物的多酚提取率和抗氧化活性的比较还未见报道，本研究使用水、甲醇和乙醇提取核桃青皮、核桃粕、核桃壳的多酚成分，比较提取率，并对其醇提物进行体外抗氧化试验，明确其抗氧化性能，以期为核桃副产物的加工和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

干核桃青皮 购于中药店，产地安徽，生产日期2017年11月；核桃粕 购于甘孜州祥瑞生态食品开发有限公司，核桃粕经液压榨油工艺产出，生产日期2018年1月；核桃壳，采集于盐亭县金土地农林发展有限公司，生产日期2017年11月。

1.2 试剂

甲醇，乙醇，硫酸亚铁，过氧化氢，水杨酸，维生素C，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，邻苯三酚，铁氰化钾，三氯乙酸，以上分析纯购于成都科龙试剂有限公司；2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 仪器

UV-1800分光光度计，日本岛津仪器有限公司；ML204电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；AS3120超声清洗机，天津奥特赛恩斯仪器有限公司； HH-2恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；R-215旋转蒸发仪，瑞士步琦有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 多酚提取液的制备

将干燥的核桃青皮、核桃粕和核桃壳粉碎，过60目分级筛备用。称取100 g样本置于500 mL锥形瓶中，按1∶5的料液比加入水、70 %甲醇、40%甲醇、70 %乙醇、40 %乙醇，在30 ℃条件下浸泡12 h，放入超声清洗仪，在30 kHz频率下超声2h，每30 min震荡一次，双层滤纸减压抽滤。收集残渣，按以上步骤反复提取3次，合并过滤液。过滤液在旋转蒸发仪中减压浓缩，用蒸馏水复溶至20 mL，测定多酚含量。

1.4.2 多酚的提取率

多酚的测定使用Folin-Ciocalteu比色法[7]。分别吸取1 mL 0.1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,0.8 mg·mL-1,1mg·mL-1没食子酸标准溶液于离心管中，再吸取1 mL多酚提取液于离心管中，在标准品和试样离心管中依次加入1.5 mL福林酚试剂，1 mL 0.2 g·mL-1碳酸钠，定容至10 mL，60℃避光水浴1 h后，在波长765 nm处测定吸光度。计算公式为：多酚提取率(以没食子酸计，mg·g-1)=(a1×v1)/(v2×w),a1：样液中多酚的含量；v1：提取样液的体积；v2：测定取样液的体积；w：核桃副产物称样量。

1.4.3 样本的稀释

通过预实验确定了样本稀释浓度，选择合理的测试浓度范围的依据是：DPPH自由基、羟自由基和对超氧阴离子自由基清除率在10～100%之间,还原力样品OD值在0.1～1之间。将各试验组多酚提取液稀释至10 μg·mL-1,30 μg·mL-1,50 μg·mL-1,70 μg·mL-1,90 μg·mL-1,110 μg·mL-1测定DPPH自由基清除能力；稀释至0.1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1,0.3 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,0.8 mg·mL-1测定羟自由基清除能力；稀释至0.1 mg·mL-1,0.2 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,1.2 mg·mL-1,1.8 mg·mL-1测定超氧阴离子自由基清除能力；稀释至20 mg·mL-1,40 mg·mL-1,80 mg·mL-1,160 mg·mL-1,320 mg·mL-1,640 mg·mL-1测定还原力。

1.4.4 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除率的测定使用延莎等人的方法[8]。用无水乙醇稀释多酚提取物配成5种浓度梯度的待测液，在10 mL试管中分别加入1 mL待测液，60%乙醇溶液2 mL，100 μmol·L-1的DPPH乙醇溶液4 mL，混匀30 s放在暗处反应30 min。用60 %乙醇调零，测定在波长515 nm处的吸光值A1。同时，测定待测液1mL与3 mL60%乙醇混合液在波长515 nm处的吸光度A0，再测定4 mL DPPH溶液与3 mL 60%乙醇在515 nm处的吸光度A2。用Vc作为对照组。计算公式为：DPPH自由基清除率=[A2-(A1-A0)/ A2] ×100% 。

1.4.5 羟自由基清除能力的测定

羟自由基清除能力的测定使用刘荣等人的方法[9]。分别取浓度为1 mmol·L-1的硫酸亚铁溶液1.0 mL，不同浓度的样品溶液1.0 mL，1 mmol·L-1的过氧化氢1.0 mL 于具塞试管中，摇匀，静置10 min，再加入浓度为3 mmol·L-1的水杨酸溶液2.0 mL，摇匀后静置30 min，于波长510 nm 处测定吸光度A2；使用上述同样的步骤，使用蒸馏水替代样品溶液，测定吸光度A0，使用蒸馏水替代水杨酸，测定吸光度A1。以维生素C为对照组，以蒸馏水调零。计算公式为：羟自由基清除能力=[ A0-(A2-A1)]/A0×100%。

1.4.6 超氧阴离子自由基清除能力的测定

超氧阴离子自由基清除能力的测定使用邻苯三酚法[8]。取不同浓度的多酚溶液1.0 mL，50 mmol/L Tris-Hcl溶液(pH值=8.0)5.0 mL 于具塞试管中，25 ℃恒温水浴20 min，取该混合溶液3.0 mL 于比色皿中，加入浓度为3 mmol·L-1的邻苯三酚溶液1 mL，摇匀，准确反应3 min，测定其在波长325 nm 处的吸光度,记录在1 s,30 s,60 s,90 s,120 s,150 s读数。另外，以无水乙醇代替样品测定邻苯三酚的自氧化程度，VC溶液为对照。计算公式为：(A0-A1)/A1×100%。A1表示小米多酚提取物溶液与邻苯三酚混合液的氧化速率，每30 s的吸光值拟合直线取其斜率，A0表示邻苯三酚的自身氧化速率，每30s的吸光值拟合直线取其斜率所得。

1.4.7 还原力的测定

还原力的测定采用普鲁士蓝法[10]。分别取不同浓度样品溶液1 mL，0.2 mol/L 的磷酸缓冲液(PBS，pH 值6.6)1 mL 和1%铁氰化钾溶液1 mL 于具塞试管中，50 ℃水浴保温20 min，快速冷却，再加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液1 mL，混合后以转速 5 000 r·min-1离心10 min。取上部清液1 mL，依次加入蒸馏水1 mL，0.1%三氯化铁溶液0.2 mL，充分混匀，静置10 min 后，在波长700 nm 下测定其吸光度，以蒸馏水调零，维生素C作为对照组。

1.4.8 分析方法

结果采用平均值±标准差表示，使用SPSS 19进行单因素方差分析和Duncan差异显著性分析，p<0.05表示差异显著，p>0.05表示差异不显著。使用Origin 2017软件作图，对体外抗氧化数据进行多项式拟合，根据方程计算IC50。

2 结果与分析

2.1 多酚提取率

不同提取试剂对核桃粕、核桃青皮和核桃壳的多酚提取率的影响见表1。核桃青皮多酚提取率最高，其次是核桃粕，核桃壳最低，这与核桃副产物自身的多酚含量呈正相关。试剂种类和浓度影响多酚的提取率，乙醇的效果优于甲醇，水的提取效果最差，40 % 乙醇浓度的提取率优于70 %。虽然，有报道称，多酚的提取率与试剂的极性呈正相关，但本试验的结果没有呈现上述规律，极性最大的水提取率最低，极性最低的乙醇提取率最高，这可能是因为提取物中多酚种类不同，不同试剂对不同种类的多酚提取率有差异，从而导致总提取率不同。另一方面，多酚类化合物在植物体内通常与蛋白质、多糖以氢键或疏水键形式形成稳定的分子复合物，因此提取试剂不仅要求对多酚类物质有很好的溶解性，而且必须具有氢键断裂的作用，有机溶液和水的混合溶液最适合多酚物质的提取[11]。水的提取率较低，因此不使用多酚水提物进行体外抗氧化试验。

表1 不同提取试剂对核桃副产物多酚提取率的影响 单位(mg·g-1)

注：同一列字母不同表示不同提取试剂对多酚提取率差异显著(p<0.05)。

2.2 DPPH自由基

不同提取试剂对核桃粕、核桃青皮和核桃壳醇提取的DPPH自由基清除率的影响见图1。WGSM、WGSE、WSM、WSE、WPM、WPE的DPPH自由基清除率的IC50(半数抑制浓度)分别为：16.41 μg·mL-1,19.91 μg·mL-1,33.42 μg·mL-1,35.80 μg·mL-1,23.31 μg·mL-1,27.22 μg·mL-1。结果显示：核桃青皮醇提物对DPPH自由基的清除效果最好，甲醇提取效果比乙醇好；核桃壳醇提物的DPPH自由基清除效果最差；3种核桃副产物醇提物对DPPH自由基的清除能力均低于维生素C。DPPH自由基是一种稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能够清除它，则提示受试物具有清除羟基自由基、烷基自由基或过氧自由基的能力和打断脂质过氧化链反应的作用，因此广泛用于评价天然或合成物质的抗氧化特性[12,13]。影响DPPH自由基的清除因素很多，例如Scalzo发现有机酸能显著增加维生素C的DPPH自由基清除效果，而有机酸自身没有任何清除作用[14]，而核桃青皮中的有机酸含量高于核桃粕和核桃壳，这对DPPH的清除可能产生协同作用。

图1 不同浓度多酚提取液对DPPH自由基的清除能力注：WGSM：核桃青皮甲醇提取物;WGSE：核桃青皮乙醇提取物;WSM：核桃壳甲醇提取物；WSE：核桃壳乙醇提取物;WPM：核桃粕甲醇提取物;WPE：核桃粕乙醇提取物。下同。

2.3 羟自由基清除能力

羟自由基是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的自由基，多余的自由基会引起体内蛋白质、酶、脂质和核酸的氧化损伤，还与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关[15]。3种核桃副产物的醇提物对羟自由基清除能力见图2。6种多酚醇提物对羟自由基的清除能力从大到小排序为：WGSM>WGSE>WSE>WSM>WPM>WPE。WGSM、WGSE、WPM、WPE羟自由基清除率的IC50分别为：0.17 mg·mL-1,0.21 mg·mL-1,0.28 mg·mL-1,0.24 mg·mL-1。6种多酚溶液的浓度与羟自由基清除能力呈正比，当多酚溶液浓度达到0.3mg/mL时，上升趋势趋于平缓。当测试液浓度为0.3 mg·mL-1,0.4 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,0.8 mg·mL-1时，六组试验组差异显著(p<0.05)，当测试液浓度为0.1 mg·mL-1时，WGSM、WGSE和WPE的羟自由基清除率显著高于WSM、WSE和WPM(p<0.05)。在多酚浓度0.1～0.8 mg·mL-1时，WGSM对羟自由清除能力强于维生素C；多酚浓度在0.1～0.3 mg·mL-1时，三种多酚醇提物的羟自由基清除能力高于维生素C，但随浓度升高，多酚醇提物的清除率趋于平缓，而维生素C呈线性上升。

图2 不同浓度多酚提取液对羟自由基的清除能力

图3 不同浓度多酚提取液对超氧阴离子自由基的清除能力

2.4 超氧阴离子自由基清除能力

氧气在生物体内生成氧自由基时，首先产生超氧阴离子自由基，它不仅自身具有毒性，而且可以经过一系列反应生成其他氧离子自由基，进一步对生物产生损害作用。3种核桃副产物的甲醇、乙醇多酚提取液对超氧阴离子自由基清除能力见图3。WGSM、WGSE、WPM、WPE羟自由基清除率的IC50分别为：0.71 mg·mL-1,0.65 mg·mL-1,1.54 mg·mL-1,1.53 mg·mL-1。对羟自由基的清除能力从大到小排序为：WGSE>WGSM>WPE>WPM>WSE>WSM。核桃粕甲醇和乙醇提取物的超氧阴离子自由基的清除能力差异不显著(p>0.05)，核桃青皮、核桃壳的甲醇和乙醇提取液浓度在0.1 mg·mL-1,0.6 mg·mL-1,1.2 mg·mL-1时，差异显著(p<0.05)，这种差异一定程度上证明了不同试剂提取多酚对抗氧化能力有较大影响，另一方面，提取物中多酚种类也是造成抗氧化能力差异的重要原因。

2.5 还原力

还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，抗氧化剂自身的还原作用能使自由基变为稳定的分子而失去活性，抗氧化能力与还原力强弱呈正相关[16]。3种核桃副产物的甲醇、乙醇多酚提取物的还原力见图4，当醇提物多酚浓度为640 μg·mL-1时，WGSM的还原力最高(A700 nm=0.93)，WSM还原力最低(A700 nm=0.51)。当多酚浓度为40 μg·mL-1,80 μg·mL-1,160 μg·mL-1,640 μg·mL-1时，不同核桃副产物多酚醇提物还原力差异显著(p<0.05)，两种提取试剂对还原力的影响差异不显著(p>0.05)。核桃青皮醇提物的还原能力与维生素C差异不显著(p>0.05)。

图4 不同浓度多酚提取液对还原力的影响

3 结论

不同的多酚提取试剂对3种核桃副产物的多酚提取有显著的差异(p<0.05)，40%乙醇为提取剂时多酚提取率最高，纯水的提取率最低。核桃青皮、核桃壳、核桃粕的甲醇、乙醇提取物对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基有一定清除能力和还原力，核桃青皮提取物抗氧化能力最强，各抗氧化性能指标等同或优于维生素C，核桃粕提取物抗氧化能力次之，核桃壳最差。核桃青皮甲醇提取物对DPPH自由基、羟自由基清除能力和还原能力最好；核桃青皮乙醇溶液对超氧阴离子自由基清除能力最好。甲醇提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除能力优于乙醇提取物，乙醇提取物对超氧阴离子自由基清除力和还原能力优于甲醇提取物。本研究对核桃副产物的利用以及其抗氧化活性提供了参考，核桃青皮多酚类物质含量丰富，提取率最高，其醇提物的抗氧化活性和还原力较维生素C强，是较好的天然抗氧化剂制备原料。