重金属胁迫对白三叶种子萌发的影响

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(1.贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550001； 2.贵州省草原监理站，贵阳 550001)

重金属是危害较大且来源广泛的土壤污染物[1]，主要指生物毒性显著的汞(Hg)、镉(Cd)、铅(Pb)、铬(Cr) 以及类金属砷 (As)，还包括具有毒性的重金属锌 (Zn)、铜 (Cu)、钴 (Co)、镍 (Ni)、锡 (Sn)。随着经济的迅速发展，重金属污染已成为危害生态最重要的环境问题之一。工业污水的排放量和农业化肥使用量逐年增多，重金属离子严重污染水体，并在土壤中大量累积，破坏土壤生态系统[2]。同时，在植物中累积，降低种子的发芽率和脂肪含量，降低植物体内一些酶的活性和叶绿素含量，抑制植物光合作用和生长发育等，严重影响植物发育，进而影响动物和人类的健康[3]。

草坪草能够吸收污染物[4-5]，对重金属污染的土壤也有很好的修复效果[6]。白三叶(Trifoliumrepens)属豆科(Leguminosae)，三叶草属多年生草本植物，又名白车轴草和白花苜蓿等，多被应用于草坪植物绿化。已有文献报道白三叶对重金属Cd胁迫有良好的耐受性[7]，同时对重金属Zn有一定的耐受性和适应性，在重金属Zn污染土壤的植物修复中有着一定的潜在应用前景[8]。此外，韦新东等研究表明，白三叶可以在低浓度的Cd和Pb污染的环境下萌发，生长[9]。在白三叶重金属胁迫方面的研究相对较多，但不够完善和集中。

为研究重金属离子对白三叶的毒害情况，本实验模拟4种不同浓度重金属离子(Zn2+、Pb2+、Cu2+、Cd2+)对白三叶种子进行胁迫处理，测定种子发芽率、发芽势、发芽指数和相对胚根(芽)长等相关指标。探讨不同重金属离子胁迫对白三叶种子萌发的影响，了解白三叶种子对四种重金属离子的耐受性关系，为白三叶作为不同重金属环境下的绿化植被提供理论依据，发掘白三叶在重金属污染修复潜力。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

试验材料：白三叶(海发，购自于贵阳种子公司)；

供试试剂：Pb(NO3)2、CdCl2、CuSO4·5 H2O、KMnO4、ZnSO4·7 H2O、Hoagland营养液。

1.2 试验方法

试验于2017年6月在贵州师范大学生命科学学院实验室内进行。重金属Zn2+、Pb2+、Cu2+和Cd2+分别以溶液的形式加入培养皿中，根据中华人民共和国国家土壤环境质量标准(GB 15618-1995)3级土壤环境标准量进行重金属离子浓度梯度的配制，浓度梯度分别为Zn2+200，500，800，1 100，1 400 mg/L；Pb2+500，1 000，1 500，2 000，2 500 mg/L；Cu2+100，200，300，400，500 mg/L；Cd2+1，50，100，150，200 mg/L[10]，同时设置对照组。

将用于实验的种子进行筛选，弃去干瘪和残缺不全的种子，用浓度为0.1%的高锰酸钾溶液浸泡待试种子15 min，然后用蒸馏水冲洗直至红色完全消失，用滤纸将种子表面的水分吸干。实验采用铺有2层滤纸的直径为90 mm的洁净培养皿为发芽床，每个培养皿均匀放入50粒种子，并加入10 mL用Hoagland营养液配制好的重金属溶液，空白对照组则直接加入等体积的Hoagland营养液。每处理重复3次。盖上皿盖并置于阴凉通风处，利用自然光源对其进行光照处理，逐日观察并记录发芽的种子数(以胚芽长度达到种子一半为判断种子发芽的标准[11])。记录10 d内白三叶种子的发芽数，并在培养结束后每皿随机挑选5颗幼苗，用镊子将萌发的幼苗取出，滤纸吸干表面水分后分别测量其胚根长和胚芽长并记录。

1.3 数据处理

所有数据使用SPSS 22.0统计软件，采用单因素LSD法对不同处理条件下的白三叶的发芽率、发芽势、发芽指数、胚根长和胚芽长等各项数据进行分析。采用Excel 2010软件进行统计并制图。

1.4 相关数据计算公式

发芽率(%)=(发芽种子数/供试种子总数)×100%；

发芽势(%)=[发芽初期(前3 d)正常发芽种子数/供试种子总数]×100%；

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)，Gt为处理t日的发芽数，Dt为相应的发芽天数；

相对胚根(芽)长=[处理草种胚根(芽)长/对照胚根(芽)长]×100%。

2 结果与分析

2.1 重金属Zn对白三叶种子萌发的影响

从表1可看出，在不同Zn2+浓度的处理下，种子的发芽率随着Zn2+浓度升高呈下降趋势，加入Zn2+的种子发芽率显著低于对照组。对照组种子的发芽率最高达到77.33%，在Zn2+浓度为500 mg/L时，种子的发芽率出现了小幅度的升高，当Zn2+的浓度大于500 mg/L时，与对照组相比发芽率显著抑制，Zn2+浓度达到1 400 mg/L时，种子的发芽率最低，为46.67%。

重金属Zn对种子发芽势有抑制作用，在Zn2+胁迫下，随着浓度升高种子的发芽势呈下降的趋势，浓度在800～1 400 mg/L时发芽势显著低于0～800 mg/L时。对照组发芽势最高,为56.67%，当Zn2+浓度在1 100 mg/L时，种子的发芽势达到最低值,为15.33%。

重金属Zn对种子发芽指数同样有抑制作用，种子的发芽指数随着Zn2+浓度的升高呈下降趋势，与对照组相比高浓度显著抑制种子发芽指数，当浓度高于800 mg/L时，抑制作用趋于平稳。对照组种子的发芽指数达到最高，为19.11，当浓度超过800 mg/L时，种子发芽指数变化不显著，Zn2+浓度为1 100 mg/L时，种子的发芽指数最低，为6.11。

表1 不同浓度Zn2+处理对种子萌发的影响

注：同列不同字母间表示差异显著(p<0.05)。下同。

2.2 重金属Pb胁迫对白三叶种子萌发的影响

由表2可知，重金属Pb胁迫下，白三叶种子的发芽率总体呈下降趋势。对照组发芽率最高，为 71.33%，当Pb2+浓度达到1 000 mg/L时发芽率有升高趋势，Pb2+浓度超过1 000 mg/L后整体显著下降，在Pb2+浓度为2 500 mg/L时出现最低值，此时发芽率为 3.33%。

表2 不同浓度Pb2+处理对种子萌发的影响

种子的发芽势呈下降趋势，发芽势显著性与发芽率基本一致。对照组发芽势最高，为56.67%，当浓度超过1 000 mg/L后呈现下降趋势，浓度高于1 000 mg/L的发芽势显著低于对照组，且在Pb2+浓度为2 500 mg/L时发芽势降至最低，为1.33%。

发芽指数呈现先升高后降低的趋势，发芽势显著性同发芽率显著性一致。对照组发芽指数最大值为16.91，在Pb2+浓度为1 000 mg/L时发芽指数有所上升，超过此浓度呈现显著下降趋势，且Pb2+浓度为2 500 mg/L时发芽指数仅为0.5。

2.3 重金属Cu胁迫对白三叶种子萌发的影响

由表3可知，重金属Cu胁迫下，种子发芽率随着Cu2+浓度的增加而降低，浓度低于300 mg/L时发芽率变化不显著，浓度高于300 mg/L呈显著下降趋势，当浓度升高至500 mg/L时发芽率最低，为38%。

Cu2+对白三叶发芽势的影响表现为下降趋势，浓度小于400 mg/L时种子发芽势变化不显著，当浓度达到500 mg/L时与对照组相比发芽势显著抑制，此时的发芽势为37.33%。

低浓度Cu2+对种子发芽指数的影响较弱，高浓度使得发芽指数降低。浓度小于200 mg/L时发指数变化不显著，当浓度高于300 mg/L时与对照组相比表现为显著抑制，浓度达500 mg/L时发芽指数最低，为8.96。

表3 不同浓度Cu2+处理对种子萌发的影响

2.4 重金属Cd胁迫对白三叶种子萌发的影响

表4表明，不同浓度Cd2+胁迫下，种子发芽率随着Cd2+浓度的增加呈先上升后下降趋势，种子在1 mg/L的低浓度处理下表现为促进作用，发芽率最高，为77.33%，超过此浓度发芽率被抑制，浓度越高抑制越明显，直到浓度为200 mg/L时发芽率达最低，为50%。

表4 不同浓度Cd2+处理对种子萌发的影响

Cd2+对种子发芽势和发芽指数的影响表现为抑制，从数据来看，发芽势和发芽指数的趋势与发芽率相同，低浓度抑制作用较小、高浓度显著抑制。

2.5 4种重金属离子处理对种子相对胚根(芽)长的影响

如图1所示，4种重金属离子胁迫下白三叶的相对胚根长明显低于相对胚芽长，表明重金属离子对胚根的影响大于胚芽。低浓度的Zn2+溶液处理对胚根生长有一定的促进作用，Zn2+浓度在200 mg/L时种子的相对胚根长显著高于对照组，随着重金属溶液浓度的升高，种子的相对胚根长呈逐渐下降趋势，表现为抑制作用，当浓度超过800 mg/L时，Zn2+对胚根的影响趋于稳定；随着Zn2+浓度增加相对胚芽长显著下降，200 mg/L的低浓度处理，胚芽长与对照组相比差异极小，当浓度高于200 mg/L时下降趋势明显。

图1 不同浓度4种重金属离子处理对种子相对胚根(芽)长的影响

低浓度的Pb2+溶液处理对胚根(芽)生长均有一定的促进作用，Pb2+浓度在500 mg/L时相对胚根(芽)长均高于对照组，随着浓度升高相对胚根长显著下降接近于零，浓度较高时种子将致死不生长。

Cu2+处理下，种子的相对胚根长随浓度的升高呈下降趋势，低浓度的Cu2+处理对种子的胚芽生长有一定促进作用，对胚根长影响不大，浓度为100 mg/L时，相对胚芽长显著高于对照组，相对胚芽长与对照组差异不显著，当浓度高于100 mg/L时，相对胚根(芽)长均显著低于对照组。

Cd2+处理下，种子的相对胚根(芽)长均随浓度升高而下降，高浓度显著抑制胚根(芽)的生长，浓度在100，150，200 mg/L时的相对胚根(芽)长变化不明显。

3 讨 论

种子的萌发和生长是植物接触外界一切反应的开端，也是其对外界刺激最为敏感的阶段[12]。种子萌发时期的发芽率、发芽势、发芽指数是判断种子发芽能力的重要指标，能够直观地反映种子的发芽速率和生长的趋势，而它的生长状况(如幼苗的相对胚根胚芽长)则直接与幼苗的生长及生物量相联系[13]。通过观察重金属溶液处理后的种子萌发情况及胚根与胚芽的发育情况，是深入研究重金属污染对植物影响的前提。

重金属处理对白三叶种子的萌发具有抑制作用，4种重金属低浓度处理，种子萌发情况与对照组相比变化较小，说明白三叶具有一定的抗低浓度重金属能力，且低浓度的Cd2+可以加速种子萌发，已有学者证明白三叶具有较强的抗重金属Cd的能力，与本实验结果基本一致[14]。浓度越高对种子萌发的抑制效应越强，但超出一定浓度(如Zn2+：800 mg/L ，Cd2+：50 mg/L)之后，对发芽率、发芽势和发芽指数的抑制效应有所消除，导致发芽率、发芽势和发芽指数出现一个小幅度的上升期或平稳期[15]。高浓度重金属Pb2+和Cu2+对种子萌发影响较大，由于植物活性氧代谢系统平衡受到影响，细胞膜遭到损伤，物质交换不能正常进行，导致植物的萌发和生长受到抑制，种子的萌发能力被打破[16]。

在不同浓度重金属离子处理下种子相对胚根长小于相对胚芽长，表明重金属胁迫首先影响白三叶根部的生长发育，从而抑制白三叶的生长。在种子的萌发时期，重金属对白三叶生长发育的影响都主要体现在抑制白三叶的根生长，也符合已有的研究结果[17]。随着浓度的升高胚根(芽)生长整体呈现显著下降趋势，与赵玉红等的结果一致[18]。低浓度重金属Zn2+和 Pb2+处理对种子的胚根(芽)生长有显著的促进作用，Cu2+和Cd2+处理下种子的胚根(芽)生长变化不大，低浓度重金属溶液处理对种子胚根(芽)生长影响较小。高浓度重金属离子胁迫对种子萌发的影响其实是不可修复的，表明大部分的种子在该环境下已经不能正常生长或种子的某些生理结构已经被破坏。有研究表明，植物吸收过量的Zn2+会对植物的根系造成损害，阻碍根的生长，从而影响植物的生长发育[19]。

研究白三叶种子萌发对重金属的响应，应从种子发芽率、发芽势、发芽指数以及相对胚根(芽)长的等多方面入手。参照国家三级土壤标准重金属浓度范围，分析可知白三叶对Cd2+的耐受能力最强，Zn2+和Cu2+次之，对Pb2+的耐受能力最弱。在Cd2+不同浓度条件下种子的发芽率均大于50%，相对胚根(芽)长大于30%，且Cd2+浓度为1 mg/L时可促进种子的萌发。而Pb2+达到一定浓度(1 500 mg/L)后发芽率小于25%，浓度在2 500 mg/L时发芽率仅为3.33%，相对胚根(芽)小于10%。此结果与已报道的研究结论吻合，即白三叶较耐镉，对铅、铜、锌耐性较差[20]。但与宋凤鸣等试验结果有一定差异，可能与品种以及重金属用量不同有关[21]。有盆栽试验研究认为，白三叶能同时富集中低度铜、镉、铅，对复合污染的土壤具有较好的修复作用[22]。虽然白三叶能够富集重金属的范围有限，但是不应该只看重单一植物的修复效果，白三叶的高生物量和强大的适应性会成为它的优势，从而得到更多更有效的应用，而这需要进行更深一步的研究。

4 结 论

综上所述，4种不同浓度重金属处理下，随着浓度的升高，种子的萌发整体表现为抑制作用，白三叶对Cd2+的耐受能力最强，Zn2+和Cu2+次之，对Pb2+的耐受能力最弱；高浓度的重金属浓度培养条件对白三叶种子萌发及生长发育会产生严重的阻碍作用，当Pb2+浓度在2 500 mg/L时发芽率仅为3.33%；低浓度重金属Zn2+、Cu2+、Pb2+环境对胚生长具有一定促进作用；重金属胁迫首先影响的是种子根部的生长发育，从而抑制白三叶的生长。对比4种重金属污染条件，白三叶对镉的耐受能力最强，在5种不同浓度的Cd2+条件下种子的发芽率均高于50%，且Cd2+浓度为1 mg/L时可促进种子的萌发，因此其作为Cd污染的土壤的修复植物有一定的前景。