15个饲用燕麦品种的遗传变异及亲缘关系分析

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(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041；3.四川农业大学草业科学系，四川 成都 610066)

燕麦是禾本科燕麦属(AvenaL.)的草本植物，是优良的一年生粮饲兼用作物。燕麦广泛分布于全世界五大洲76个国家，主要种植于亚洲、欧洲、北美洲北纬40°以北地区[1]。目前在生产上广泛应用的燕麦包括普通栽培燕麦(皮燕麦)(A.sativa)和大粒裸燕麦(A.nuda)[2]，其中皮燕麦的种植面积最大，主要为饲用。我国主要种植裸燕麦，主要食用，少数饲用。燕麦的饲用价值较高，其籽实、稃壳、茎叶等均是各种家畜的优良饲料。燕麦喜冷凉，耐贫瘠，可在高海拔和高纬度地区种植，已经成为我国青藏高原高寒牧区高产人工草地建设的当家草种，对缓解高寒地区家畜冬季缺草的问题具有重要的作用[3]。

图1 供试燕麦品种醇溶蛋白电泳图谱

目前在青藏高原地区主要种植的燕麦品种包括青引1号、青引2号等国产燕麦品种及部分国外进口燕麦品种，而目前对这些燕麦品种间的遗传变异等方面的研究还较少，有必要对不同燕麦品种间的遗传差异及亲缘关系进行分析，这对燕麦品种的鉴定及杂交种质的创制等方面具有重要的意义[3]。此外，在高寒地区牧草种子生产及推广应用过程中，种子的混杂情况较为严重，所以对不同的牧草品种建立相关的纯度及真实性的鉴定技术，对于牧草品种的推广应用具有重要的作用。目前在牧草中包括多花黑麦草、鸭茅等都建立有相关品种的分子标记指纹图谱[4-5]，常用的方法技术包括醇溶蛋白电泳、SSR、SNP等DNA分子标记电泳等[4-7]。种子醇溶蛋白电泳、SSR、AFLP等分子标记均在燕麦种质评价、遗传多样性研究等方面成功运用[8-10]。本研究采用种子醇溶蛋白电泳对目前高寒地区常用的燕麦品种开展其遗传变异及亲缘关系的分析，为燕麦品种的鉴定以及资源的保护、利用等提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

表1 供试材料

供试材料为15个饲用燕麦品种，其中青引3号、青莜3号为裸燕麦(A.nuda)，砂燕麦(A.strigosa)为二倍体栽培燕麦，其余12个燕麦品种均为普通栽培燕麦(A.sativa)，大多数品种为目前青藏高原高寒地区主要种植的品种(详见表1)，以小麦品种中国春作为醇溶蛋白图谱的对照。

1.2 醇溶蛋白电泳分析

1.2.1 样品提取

每个燕麦品种随机选取5粒种子，设置2个重复。将皮燕麦种子去皮研磨成粉末并称重，将其转入1.5 mL 离心管，按照1 mg加5μL 的比例加入醇溶蛋白提取液(2-氯乙醇25%+甲基绿0.05%)，室温浸提过夜，使用前10 000 r/min离心15 min。为了鉴定品种的真实性，选择青燕1号为检测对象，随机选取50粒种子，醇溶蛋白提取步骤同上。

1.2.2 A-PAGE分析

采用国际种子检验协会ISTA(1986)颁布的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE，pH 3.2)标准程序[11]。采用DYCZ-24 F型电泳槽(北京六一仪器厂)进行电泳，恒压500 V，恒温10～15 ℃，电泳1.5 h。电泳结束后用10%的三氯乙酸固定30 min，后加入1%的考马斯亮蓝R-250染液进行染色过夜，7%的醋酸溶液褪色，数码相机采集照片保存。

1.3 数据分析

对获得的电泳条带按有带记为1，无带记为0统计，将醇溶蛋白条带转换成0，1矩阵。利用软件NTSYS-pc 2.10计算Dice遗传相似系数(GS)，并基于该遗传相似系数进行非加权成对算术平均法(UPGMA)聚类分析和主成分分析(PCA)[12]。

2 结果与分析

2.1 醇溶蛋白多态性

15份材料共扩增出18条醇溶蛋白条带，均为多态性条带，醇溶蛋白位点多态率为100%(如图1)。每个品种扩增的醇溶蛋白条带数为4～10条，燕麦的醇溶蛋白条带主要以迁移率较大的为主，分子量较小的位点，主要分布于α和β区域。每份品种随机挑选5粒种子，并设置2个重复，2个重复的电泳条带均保持一致，这也表明醇溶蛋白电泳在燕麦中具有较好的重复性(如图1)。本研究中醇溶蛋白电泳能够将供试的13个品种分开，仅有青海444和青燕1号2个品种的带型完全一致，说明醇溶蛋白对于燕麦品种具有较好的鉴别能力。此外，为了鉴定燕麦种子的真实性，随机选择青燕1号燕麦的50粒种子进行电泳，从电泳图谱来看完全一致，表明该品种具有较高的纯度(如图2)，同时说明醇溶蛋白电泳是燕麦种子真实性鉴定的一种有效方法。

图2 青燕1号燕麦品种种子纯度检测电泳图谱

2.2 遗传相似系数

基于醇溶蛋白数据，计算供试15个品种间的DICE遗传相似系数，其变异范围为0.143～1.000，平均值为0.527，说明供试品种间遗传变异较大。其中青莜3号与青海甜燕麦的遗传关系最远，相似系数最低,为0.143；青海444和青燕1号的醇溶蛋白图谱完全一致，遗传相似系数为1.000，亲缘关系最近。

2.3 聚类和主成分分析

基于醇溶蛋白的聚类分析结果(图3)表明，供试的15个燕麦品种被分成6类。砂燕麦与其他燕麦品种的遗传距离最远，单独聚为一类(Ⅰ)。第Ⅱ、Ⅵ类均只包含一份材料，分别为阿坝燕麦和青引1号，其表现出了与其他品种的特异性。第Ⅲ类包括了青海444、青燕1号和青海甜燕麦，其中青海444与青燕1号的亲缘关系非常近。第Ⅳ类包括了青引2号、莫妮卡和骏马3个品种。第Ⅴ类包括剩下的6个品种，其中林纳、青莜3号又聚为一个亚类，青引3号与加燕2号聚为一个亚类，大汉与白燕7号聚为一个亚类。主成分分析结果与聚类分析结果基本一致，其中前3个主成分分别可以解释总遗传变异的56.74%、14.39%、7.35%(图4)。

图3 聚类分析图

图4 主成分分析

3 讨 论

麦类作物及其近缘物种种子中的醇溶蛋白带谱严格受遗传基因控制，不受环境等外界环境因素的影响，且不同材料或者品种间差异显著，变异类型也较丰富，目前已经广泛应用于小麦、燕麦等麦类作物及近缘物种品种真实性及纯度鉴定等研究[13]。齐冰洁等[8]采用A-PAGE电泳对74份燕麦进行分析，共分离出19种不同的醇溶蛋白带纹，73种醇溶蛋白图谱，揭示其存在丰富的等位变异。罗桂花等[14]采用醇溶蛋白电泳分析了42份青海燕麦农家品种，其中包括29份皮燕麦，13份裸燕麦，共检测出6条迁移率不同的谱带，5种电泳图谱类型，其变异类型较少，可能与其均来自青海地区有关。刘敏轩等[15]采用醇溶蛋白超薄层等电聚焦电泳技术分析了7个饲用燕麦品种，共分离出34条不同迁移率的谱带，其中85%的具有多态性，并成功分离鉴定了7个燕麦品种及其纯度。本研究采用A-PAGE电泳对15个品种进行分析，共检测到18条不同的醇溶蛋白位点，其多态性达到100%，存在14种图谱类型，成功分离鉴定出13个品种。这些结果表明，醇溶蛋白电泳能够作为一种简单、快速、有效的手段进行燕麦品种真实性及纯度的鉴定。

聚类分析结果表明，二倍体栽培燕麦类型砂燕麦与其他六倍体栽培燕麦的遗传关系较远，分化非常明显。而供试材料中的皮燕麦和裸燕麦的分化反而不是很明显，如青莜3号裸燕麦与林纳皮燕麦亲缘关系更近，青引3号与加燕2号亲缘关系相对更近。这也表明在燕麦种质等研究中，倍性对燕麦种质特性的影响更为明显，这在不同倍性燕麦的抗旱性评价中得到了印证[16]。在六倍体栽培燕麦中，阿坝和青引1号燕麦也与其他品种间表现出了一定的特异性，在生产上也表现出早熟、高产等特性，可以为后续的杂交种质组配等提供参考。另外，青燕1号、青海444和青海甜燕麦3个品种的亲缘关系较近，特别是青海444与青燕1号的醇溶蛋白带谱完全一样，其在种子的外稃上均呈现出黑色。下一步研究将借助SSR等高分辨率的分子标记进行进一步的区分和分子指纹图谱的构建。

4 结 论

本研究采用A-PAGE电泳对15个饲用燕麦品种的醇溶蛋白进行分析，共扩增出18条带，多态性达到100%，结果揭示了供试品种间具有较大的遗传变异。聚类分析等结果表明，砂燕麦、阿坝、青引1号与其他品种亲缘关系较远，其中青燕1号和青海444的亲缘关系最近。