Hepassocin:一种新型的肝细胞因子

吕枭锐 龚凤英

中国医学科学院，中国协和医科大学，北京协和医院内分泌科，卫健委内分泌重点实验室，协和转化医学中心，北京 100730

非酒精性脂肪性肝病( NAFLD) 是一种除酒精和其他明确的损肝原因所导致的以肝脂肪变性为基本病理特征的肝病综合征。NAFLD主要包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌［1］。在全世界范围内约有70%的超重成年人患有NAFLD［2-3］。2 型糖尿病是一种长期代谢紊乱性疾病，其特征为高血糖、胰岛素抵抗和胰岛素相对缺乏。截至2015 年，全球约有3.92 亿人被诊断患有糖尿病，并且年轻人的患病比例逐年升高［4-6］。Hepassocin( HPS) 是Hara等［7］在2000 年发现的一种能够促进肝细胞再生的肝细胞因子。近几年的研究发现，在NAFLD患者体内，HPS 的表达和分泌增加，参与肝脂质合成和聚集; 而在2 型糖尿病患者中，HPS 与胰岛素抵抗发生密切相关。

1 HPS 概述

1．1 HPS 的发现和基因结构 2000 年，Hara等［7］发现了一种在再生大鼠肝脏中表达上调的蛋白，并将其命名为HPS。随后，利用大鼠cDNA 作为探针，获得了人源性HPS［8］。哺乳动物HPS 高度同源。在切除信号肽前、后，人类和大鼠的HPS 蛋白分别具有81.4%和83.8%的同源性。该蛋白也被称为肝细胞源性纤维蛋白原相关蛋白-1( hepatocytederived fibrinogen-related protein-1，HRFEP-1) 或纤维蛋白原相关蛋白-1( FGL-1) 。人HPS基因位于染色体8p22，由8 个外显子组成，编码由312 个氨基酸构成的分泌性蛋白。HPS 在体内以同源二聚体形式发挥作用。在还原和非还原条件下，其相对分子质量分别为34 000和66 000［7，9］。HPS 在肝脏中表达较高，且只表达于肝实质细胞，而在内皮细胞中不表达。在成人肝脏中的表达强于胎肝，而在胰腺中表达较弱，在其他组织中均不表达［7-8］。

1．2 HPS 表达的调节 最初发现，HPS 在肝脏再生过程及D 半乳糖诱导的急性肝损伤中表达上调［7］。除此之外，HPS 的表达还受下列因素的调节。高血糖能促进HPS 的表达。在链脲佐菌素诱导的高血糖小鼠模型中，肝脏HPS 表达上调。使用胰岛素或根皮苷( phlorizin) 降低小鼠血糖后，HPS 的表达随之减少。进一步研究表明，高血糖促进HPS 的表达主要通过激活信号转导与转录激活因子3( STAT3)和蛋白磷酸酶2A-肝细胞核因子1( PP2A-HNF1) 等途径来实现的［10］。也有文献报道，肝细胞核因子1α( HNF1α) 是HPS 的肝脏特异性顺式作用元件。在肝癌细胞系HepG2 细胞中转染HNF1α 后，HPS 的mRNA 含量明显增加。后续实验发现，HNF1α能作用于HPS 启动子中的HNF1结合位点，并将肝脏特异性基因表达调控因子cAMP效应元件结合蛋白( CREB) 结合蛋白( CBP) 和高迁率族蛋白1( HMGB1) 募集至HPS 启动子中，从而促进HPS 的表达［11］。另外，油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸也能激活STAT3。STAT3与HPS 启动子结合，从而促进HPS 的表达［12］。还有研究表明，棕榈酸酯能通过促进CCAAT增强子结合蛋白β 与HPS 启动子结合，激活转录过程，从而增加HPS 的表达［13］。除上述几种因素能够上调HPS 的表达外，白细胞介素-6、高脂饮食喂养、衣霉素也能促进HPS 的表达，而具体机制还需要继续探究［11，13-14］。

2 HPS 的作用

2．1 促进正常肝细胞增殖 有研究报道，HPS 高表达于斑马鱼的整个肝脏发育过程［15］。与HPS 高表达的斑马鱼相比，HPS 低表达的斑马鱼肝脏表型相对更小。进一步检测细胞增殖标志物磷酸化组蛋白H3 发现，HPS 低表达的斑马鱼肝细胞增殖率下降75%以上，提示HPS 通过促进斑马鱼肝细胞增殖，导致肝脏体积增大。用HPS 处理原代培养的大鼠、小鼠、狗、兔肝细胞后，DNA 合成所必需的［3H］胸苷利用率明显增加，说明HPS 能促进肝细胞DNA 的合成［8］。还有研究在人肝细胞系L02 细胞分泌的乳糜微粒中检测到了HPS 的表达。用这种乳糜微粒处理L02 细胞后，L02 细胞增殖率明显增加。而使用抗体抑制HPS 的表达后，L02 细胞增殖率则随之降低。说明L02 细胞能分泌HPS，后者通过自分泌的作用促进L02 细胞的增殖［16］。除此以外，HPS在肝脏再生过程中也能促进肝细胞增殖。对肝部分切除术后的大鼠肝脏再生研究发现，与对照组相比，HPS mRNA的表达水平增加了10 倍以上［7］。HPS的表达增加与肝脏再生过程具有同步性。后续使用HPS 处理肝部分切除的小鼠后，细胞增殖相关指标增殖细胞核抗原阳性肝细胞数显著升高［17］。表明HPS 对正常肝细胞增殖具有重要的正向调节作用。研究发现，用HPS 处理人和大鼠肝细胞后，细胞内的细胞外信号调节激酶( ERK) 1/2 磷酸化水平明显增加，而使用U0126( 一种ERK1/2抑制剂) 则抑制HPS 诱导的正常肝细胞增殖。提示在人和大鼠的肝细胞中，HPS 的促增殖作用均与ERK1/2 磷酸化密切相关［16-19］。进一步研究发现，在人类L02 细胞中HPS 能通过诱导Src( 也称c-Src，是Src 家族蛋白酪氨酸激酶成员之一) 磷酸化，进而反式激活表皮生长因子受体( EGFR) ，促进ERK1/2磷酸化，从而发挥对正常肝细胞的促增殖作用［18］。

2．2 抑制肝癌细胞增殖 与对正常肝细胞的作用不同，HPS 在肝癌细胞中表达较低，能够抑制肝癌细胞增殖。如前所述，HPS 在HepG2细胞中的表达与HNF1α呈正相关，而在HepG2细胞中的HNF1α表达较低，导致HPS 的表达随之下调［11］。也有学者认为HPS 在肝癌细胞的低表达与LFIRE-1/HFREP-1基因的缺失或突变有关［9］。HPS 由HFREP-1基因编码产生。而LFIRE-1是HFREP-1的肝脏特异性的同源基因，具有与HFREP-1相同的开放式阅读框架，也能表达产生 HPS。此外，研究表明，LFIRE-1/HFREP-1基因在肝癌细胞中表达随肝癌分化程度增加而降低。动物实验发现，使用二亚基硝胺处理野生型和FGL-1基因敲除( FGL-1基因编码HRFEP-1蛋白，后者与HPS 高度同源) 的小鼠后，FGL-1基因敲除小鼠肝细胞癌发病率是野生型小鼠的两倍左右［20］。而将过表达正常LFIRE-1/HFREP-1 基因的肝癌细胞注射入裸鼠皮下后，裸鼠形成的肿瘤体积与对照组小鼠( 未过表达正常LFIRE-1/HFREP-1基因) 相比明显缩小［9］。细胞实验发现，抑制肝癌细胞中的LFIRE-1/HFREP-1表达后，癌细胞计数较对照组增加1.3 ～1.4 倍［9］。另外，有学者研究发现，HPS 的分泌受其氨基端信号肽的调控。将过表达野生型HPS 的质粒( pcDNA-HPS) 和去除信号肽的HPS 突变体质粒( pcDNA-△N22) 转染入HepG2细胞后，与转染对照质粒相比，转染野生型和突变体质粒的细胞集落形成能力分别降低31.5%和70.0%，说明野生型HPS 过表达能显著抑制肝癌细胞的增殖，而去除HPS 的信号肽后，由于HPS 不能分泌到细胞外，其抑制肝癌细胞增殖的作用更强［16］。研究发现，HPS能通过上调细胞周期相关因子P53和P27，同时下调细胞周期蛋白( cyclin) D1，使细胞周期停滞在G0/G1阶段，从而抑制HepG2细胞的增殖［16］。也有实验表明，FGL-1基因敲除小鼠通过异常激活蛋白激酶B 磷酸化以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的下游靶点真核细胞翻译起始因子4E 结合蛋白1(4EPB1) ( 一种能调节细胞增殖的激酶，抑制其与真核细胞翻译起始因子4E 的结合，能延缓肝癌的发生、发展) 和p70S6K( 一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其活性为调节蛋白质合成和细胞增殖) 等与细胞增殖相关的信号通路，从而诱导肝癌的发生［20］。这些结果表明，HPS 在肝癌细胞中主要扮演抑癌因子的角色，其能抑制肿瘤的发生、发展。

但是关于HPS 与肝癌细胞增殖的关系，也有结论不一致的情况。Hara 等［8］和Li 等［17］的实验发现，HPS 不能调节人肝癌细胞系HepG2 和SMMC-7721细胞的增殖。使用HPS 处理这两种细胞后，肝癌细胞增殖率并无明显降低。导致这些研究结果不一致的原因尚需进一步研究。

2．3 减轻急性肝损伤 研究发现，HPS 能够降低急性肝衰竭动物的死亡率，说明HPS 对肝脏具有保护作用［19］。在四氯化碳和D 半乳糖诱导的急性肝损伤大鼠模型中，注射重组HPS 后，组织切片观察到肝细胞坏死、空泡变性、中性粒细胞浸润程度显著减轻。血清学检测到谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平明显下降［17］。机制研究表明，HPS 能抑制促凋亡因子Bax 和caspase 9的表达，同时促进抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL的表达，通过抑制肝细胞凋亡，从而减轻急性肝损伤时肝脏的受损程度［17］。另外，Zou等［21］研究发现，骨髓间充质干细胞( BMSCs) 能够用于治疗急性肝损伤。与对照组相比，使用BMSCs处理肝细胞后，凋亡相关指标Bcl-2表达增加，而Bax 的表达减少。在肝细胞凋亡减少的同时还检测到了HPS表达及STAT3磷酸化水平增加，提示BMSCs对肝细胞的抗凋亡作用可能与HPS 及STAT3磷酸化有关。总之，在急性肝损伤状态时，HPS 能通过调节凋亡相关因子抑制肝细胞凋亡，从而减轻肝脏的受损程度。

2．4 减轻高血糖对肝脏的不良影响 机体在高血糖状态时会产生活性氧簇，破坏肝脏的结构和功能。有文献报道，使用HPS 处理链脲佐菌素诱导的高血糖小鼠模型后，检测到超氧化物歧化酶1( SOD1) 的表达增加以及小鼠肝组织的病理变化和功能明显改善［10］。在细胞水平，使用HPS 处理HepG2细胞后，细胞内ERK1/2 磷酸化和核因子E2 相关因子2( NRF2) 水平显著增加，SOD1 的表达也随之增加。而使用ERK1/2抑制剂( U0126) 后，NRF2及SOD1的表达随之降低。以上结果说明，HPS 能通过ERK1/2和NRF2途径上调SOD1的表达，从而减少活性氧簇的产生，并改善细胞活力。表明上调HPS 表达能够减轻高血糖对肝脏的不利影响。

3 HPS 与NAFLD

肝脏能合成并分泌许多蛋白质，其中包括HPS在内的一些蛋白质会被分泌到循环中［19，22-23］。而肝脏发生脂肪变性时，由于合成机制和分泌途径受到影响，其分泌的蛋白质含量也会发生改变［24］。人体研究显示，NAFLD 患者血清中HPS 的表达显著高于对照人群［14，25］。通过在快速冷冻的肝脏活检标本中测定肝脏基因的表达发现，NAFLD患者的肝细胞中HPS 基因表达较对照人群升高2 倍以上［26］。动物实验发现，与对照组相比，注射HPS表达质粒的小鼠肝脏甘油三酯、脂肪生成相关蛋白及血清转氨酶水平均显著升高。NAFLD活动度积分相关指标如肝脂肪变性、炎性反应以及气球样变也均明显升高［14］。而下调HPS 的表达后，这些指标都得到有效改善。在细胞水平，抑制HPS 的表达能减少HepG2细胞中的脂质聚集，降低ERK1/2磷酸化程度及肝脂肪生成相关蛋白表达水平。提示HPS 在肝细胞中通过ERK1/2 通路诱导肝脂肪聚集［14］。另外，Cheng等［12］发现，不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸等能促进HepG2细胞内HPS的表达增加，并诱导细胞内的脂质聚集。Cheng等［12］认为，不饱和脂肪酸促进细胞脂质聚集的能力与HPS 表达增加密切相关。因此，发生NAFLD时HPS 的表达和分泌增多，HPS 通过诱导肝脏脂肪生成和聚集参与NAFLD的发生、发展。

4 HPS 与2 型糖尿病

研究发现，在糖尿病前期或2 型糖尿病患者体内，HPS 的血浆浓度显著增加，并与空腹血糖受损、糖耐量减低和胰岛素抵抗相关［25，27］。采用重组HPS 干预小鼠后，小鼠胰岛素水平及稳态模型评估-胰岛素抵抗指数均升高两倍以上。葡萄糖耐量试验和高胰岛素血症-正常血糖钳夹试验发现，HPS 能够使小鼠对葡萄糖的利用率降低，并导致胰岛素抵抗。而抑制HPS 的表达，则能明显增加高脂饮食诱导肥胖小鼠和( 或) 遗传性糖尿病小鼠的葡萄糖利用率和胰岛素敏感性［27］。使用重组HPS 作用于肝癌细胞HepG2和骨骼肌细胞C2C12后，胰岛素介导的胰岛素受体底物-1和蛋白激酶B 磷酸化水平降低，葡萄糖的摄取率也降低，表明细胞对胰岛素的敏感性降低［13，27］。进一步研究发现，在HepG2细胞中，使用ERK1/2抑制剂能剂量依赖性地改善HPS 诱导的胰岛素抵抗，提示在肝细胞中HPS 通过作用于ERK1/2通路导致胰岛素抵抗［27］。在骨骼肌细胞中HPS 则通过不同的机制发挥作用。利用siRNA抑制c-jun氨基末端激酶的表达后，HPS 诱导的胰岛素抵抗明显改善。表明HPS通过作用于EGFR/c-jun氨基末端激酶通路诱导骨骼肌细胞的胰岛素抵抗［13］。

综上所述，HPS 是一种新近发现的肝细胞特异性分泌的蛋白质。研究发现，其能促进正常肝细胞增殖，抑制肝癌细胞增殖，在急性肝损伤时通过抑制肝细胞凋亡保护肝脏，并具有减轻高血糖所导致的肝细胞氧化应激的作用。在NAFLD患者中，HPS 的表达和分泌增多。HPS 通过诱导肝脏脂质合成和聚集，参与NAFLD的发生和发展。另外，在2 型糖尿病患者中，HPS的血浆浓度显著增加，并且能导致肝脏和骨骼肌等组织器官产生胰岛素抵抗。这些研究表明，HPS 不仅能调节肝细胞增殖和凋亡，还与NAFLD和2 型糖尿病的发生、发展密切相关。但是作为一个新近发现的肝细胞因子，还有许多问题需要进一步研究，如血清HPS 在NAFLD和糖尿病患者中升高的机制，它是这些疾病发生的原因还是结果，HPS 对正常肝细胞和肝癌细胞增殖的作用及具体机制，是否可以从中找到治疗肝癌的新靶点。