阻断STAT3信号通路对恶性淋巴瘤细胞凋亡的影响

姚金晓，杨如玉#，马海龙，李超，魏旭东

1南阳市中心医院血液内科，河南 南阳 473000

2郑州大学附属肿瘤医院血液科，郑州 4500080

恶性淋巴瘤主要表现为淋巴结肿大，是一种起源于淋巴造血系统的常见恶性肿瘤，由于淋巴系统分布较广，淋巴瘤几乎可以作为一种全身性疾病危害全身的组织和器官[1]。放射治疗、化学药物治疗、造血干细胞治疗、手术治疗是目前常用的治疗淋巴瘤的手段，但这些传统的治疗手段仍然不能满足需求，因此，研究淋巴瘤的发病机制，寻找治疗淋巴瘤的有效手段十分重要[2]。信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是STAT家族的成员之一，能够调控细胞的分化、增殖、凋亡等过程，是细胞因子/生长因子信号通路传递过程中的重要转录因子[3-4]。STAT3不仅在细胞正常的生长过程中具有调控作用，还参与糖尿病、肿瘤等疾病的发生过程[5-6]。本研究主要以恶性淋巴瘤细胞为研究对象，通过用JSI-124阻断STAT3信号通路，探讨STAT3信号通路在恶性淋巴瘤细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

恶性淋巴瘤细胞株Raji购自中国科学院细胞库，JSI-124购自美国Sigma公司，细胞蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量检测试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒购自美国Thermo公司，细胞周期蛋白D1（cyclin D1）多克隆抗体、STAT3多克隆抗体、磷酸化的STAT3（p-STAT3）多克隆抗体、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteine aspartic acid protease 3，cleaved caspase 3）多克隆抗体均购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养

用含有2 mmol/L的左旋谷酰胺、10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100 U/L链霉素的RPMI1640培养液培养恶性淋巴瘤细胞Raji。培养3天后，1000 r/min离心10 min，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2次使细胞沉淀，用新鲜细胞培养液悬浮后，接种到培养瓶中继续培养。

1.3 噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）法检测细胞增殖

取培养至对数生长期的Raji细胞种植到96孔细胞培养板中，每孔5000个细胞。在培养液中加入 JSI-124，使其终浓度分别为：0、200、400、800、1600 nmol/L，每个浓度梯度设置6个复孔，培养48 h后，每孔加入 10 μl的MTT，孵育 4 h。弃上清，加入150 μl的二甲基亚砜溶液，测定490 nm处各组的吸光度（absorbance，A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=（JSI-124作用组A 值÷0 nmol/L JSI-124作用组A值）×100%，采用Compusyn软件计算半数抑制浓度。实验重复3次，取均值。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取0、600 nmol/L的JSI-124作用48 h后的Raji细胞，用冰预冷的PBS洗涤2次后，将细胞浓度调整为1×106/ml，加入结合缓冲液悬浮细胞后，依次加入 5 μl的 Annexin V-FITC和 PI。采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平，分析凋亡率。实验重复3次，取均值。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

取0、600 nmol/L的JSI-124作用48 h后的Raji细胞，离心，收集细胞沉淀，用-20℃预冷的70%乙醇固定，加入PI，避光染色30 min。采用流式细胞仪分析细胞周期。实验重复3次，取均值。

1.6 Western blot法检测cyclin D1、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase 3蛋白表达

取0、600 nmol/L的JSI-124作用48 h后的Raji细胞，提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取蛋白样品与等体积的上样缓冲液混合，100℃煮沸5 min。移液枪吸取50 μl的变性样品至加样孔中，用12%分离胶（120 V电压）、5%浓缩胶（90 V电压）电泳。4℃转膜60 min，400 mA转膜电流。用封闭液（5%牛血清白蛋白）室温孵育1 h后，与一抗（1∶1000稀释，4℃过夜）和二抗（1∶2000稀释，室温1.5 h）孵育后，显色，AlphaImager成像分析，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白光密度值÷GAPDH光密度值。实验重复3次，取均值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0统计-软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组比较采用两独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖情况的比较

随着JSI-124作用浓度的升高，细胞存活率逐渐下降（表1）。计算其半数抑制浓度为（615.62±52.98）nmol/L，故后续选用600 nm/L的 JSI-124作用于恶性淋巴瘤细胞。

表1 不同浓度JSI-124作用后细胞存活率的比较（%，±s）

表1 不同浓度JSI-124作用后细胞存活率的比较（%，±s）

注：a与0 nmol/L作用组比较，P＜0.05；b与200 nmol/L作用组比较，P＜0.05；c与400 nmol/L作用组比较，P＜0.05；d与800 nmol/L作用组比较，P＜0.05

JSI-124作用浓度（nmol/L）0 200 400 800 1600 F值P值细胞存活率100.00±8.36 81.68±6.61a 65.36±5.63a b 43.15±3.51a b c 30.87±2.37a b c d 144.404 0.000

2.2 细胞凋亡情况的比较

0、600 nm/L的JSI-124作用后的细胞凋亡率分别为（9.51±1.19）%、（57.58±12.02）%。600 nm/L作用组细胞凋亡率明显高于0 nm/L作用组（t=9.748，P＜0.01）。（图1）

图1 0、600 nm/L的JSI-124对细胞凋亡的影响

2.3 细胞周期情况的比较

600 nm/L作用组G0/G1期细胞所占比例明显低于0 nm/L作用组，G2/M期细胞所占比例明显高于0 nm/L作用组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；两组S期细胞所占比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表 2）

表2 0、600 nm-/L的JSI-124作用后各分期细胞比例的比较（%，±s）

表2 0、600 nm-/L的JSI-124作用后各分期细胞比例的比较（%，±s）

J SI-1 2 4作用浓度（n m o l/L）0 6 0 0 t值P值G 0/G 1期7 5.6 3±8.8 4 3 8.9 2±6.5 7 8.1 6 4 0.0 0 0 S期1 4.6 2±5.2 8 1 9.2 1±3.2 5 1.8 1 3 0.1 0 0 G 2/M期9.7 5±4.6 8 4 1.8 7±5.7 0 1 0.6 6 8 0.0 0 0

2.4 cyclin D1、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase 3蛋白相对表达水平的比较

600 nm/L作用组p-STAT3、cyclin D1蛋白相对表达水平明显低于0 nm/L作用组，cleaved caspase 3蛋白相对表达水平明显高于0 nm/L作用组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（图2、表3）

图2 0、600 nm/L的JSI-124作用后cyclin D1、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase 3蛋白的表达情况

表3 0、600nm/L的JSI-124作用后cyclinD1、STAT3、p--STAT3、cleaved caspase 3蛋白相对表达水平的比较（±s）

表3 0、600nm/L的JSI-124作用后cyclinD1、STAT3、p--STAT3、cleaved caspase 3蛋白相对表达水平的比较（±s）

JSI-124作用浓度（nmol/L）p-STAT3STAT3cyclin D1cleavedcaspase 3

3 讨论

STAT3是研究较多的转录因子，其活跃性较高，在肿瘤中异常激活，与肿瘤细胞的生长、转移、分化、凋亡等有关[7]。STAT3蛋白具有多种功能，这是由于其含有多个功能结构区域，主要包括DNA结构域、保护性氨基端、SH2结构域和STAT二聚化羧基端[8-10]。有研究表明，STAT3异常活化后，会导致细胞的恶性增殖，减少细胞凋亡，促进肿瘤的发生[11]。JSI-124是一种三萜类化合物，能够特异性抑制STAT3信号通路的激活，且目前无论是体外还是体内的研究均未发现其毒性作用[12]。250～1000 nm/L的JSI-124作用后的胆囊癌细胞的增殖能力下降，凋亡率升高[13]。后续的研究报道称，JSI-124还能够抑制肝癌细胞生长，并且对白血病细胞的生长也具有抑制作用[14-15]。本研究采用Raji细胞作为研究对象，用不同浓度的JSI-124作用后，细胞的存活率呈浓度依赖性下降，细胞凋亡率明显增高，G0/G1期细胞减少，G2/M期细胞增多。JSI-124能够抑制恶性淋巴瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G2/M期。

cyclin D1是STAT3的靶基因，定位于染色体11q13，是细胞周期蛋白成员之一，也是目前研究较为深入的细胞周期蛋白[16]。cyclin D1可以与细胞中周期蛋白依赖激酶特异性结合，并使之激活进而调控级联信号分子在G1～S转换期间发生磷酸化，影响基因的转录和表达[17]。cyclin D1能够促使细胞从G1期进入S期，是细胞周期的正调控蛋白。cyclin D1在正常的细胞中表达量较为恒定，当其过表达后，会导致细胞G1期缩短，细胞增殖速度加快[18]。在脑胶质瘤、淋巴瘤、鼻咽癌等多种肿瘤中均发现cyclin D1高表达[19]。

caspase蛋白家族参与肿瘤细胞的凋亡，是与细胞凋亡密切相关的蛋白家族[20]。caspase 3是凋亡执行因子，在正常情况下以酶原形式存在，当受到外界信号刺激后被活化成cleaved caspase 3，促进细胞凋亡发生[21]。本研究结果显示，JSI-124作用后的恶性淋巴瘤细胞中cleaved caspase 3水平升高，cyclin D1水平下降，这与细胞周期和凋亡检测结果一致。

综上所述，阻断STAT3信号通路能够降低恶性淋巴瘤细胞增殖能力，促进恶性淋巴瘤细胞凋亡，将细胞周期阻滞在G2/M期，促进caspase 3活化，降低cyclin D1表达水平。STAT3作为重要的转录因子信号通路，在肿瘤中的作用日益受到关注，靶向抑制其激活可能是治疗肿瘤的有效方法。