重组玉米赤霉烯酮酶ZENC降解麸皮毒素的条件优化

毕 可， 马 成， 王文博， 肖志壮， 张大伟

（1.生物工程学院，齐鲁工业大学（山东省科学院），山东济南250353；2.青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛266111）

玉米赤霉烯酮是一种雌激素类霉菌毒素，又称F-2毒素，其从发霉玉米上的赤霉菌中首次分离得到并于1966年由Urry等确定了其分子结构（Urry等，1966）。玉米、小麦、水稻等多种粮食作物均会不同程度的受到玉米赤霉烯酮的污染，动物摄入玉米赤霉烯酮污染的饲料后，会出现一系列生殖异常现象，如死胎、流产、幼崽体重下降等，降低了动物的生殖能力（Zinedine等，2007）。利用改性蒙脱石等矿物质的物理吸附作用，是目前饲料加工中降低霉菌毒素毒副作用的主要手段，但由于玉米赤霉烯酮分子的极性较小，物理吸附去除率较低。

相对于传统的物理吸附法，酶解方法具有降解条件温和，作用专一性强等特点，并且能够在降解玉米赤霉烯酮的同时保留饲料原有营养价值（成博伦等，2015）。Takahashi-Ando等（2002）筛选到一株粉红螺旋聚孢霉 （Clonostachys rosea）IFO7063可以将ZEN完全转化为没有雌激素活性的代谢产物，并成功获得了降解酶ZHD101。程波财等（2010）成功在重组毕赤酵母中表达了与ZHD101高度同源的玉米赤霉烯酮降解酶，可水解玉米赤霉烯酮12-C的酯键，破坏玉米赤霉烯酮的结构，降低玉米赤霉烯酮与雌激素受体的结合能力。研究表明，在重组毕赤酵母中也成功表达了来源于粗糙链孢霉的酯水解酶ZENC，对玉米赤霉烯酮的降解途径与ZHD相同，酶活pH为6.0～9.5，温度为20～50℃（程波财等，2010）。

麸皮是面粉加工生产的副产物，也是一类常用的饲料原料，但霉菌毒素含量较高。发酵麸皮是乳酸菌发酵生产的一类发酵饲料，可改善动物肠道健康，降低畜舍氨臭。本研究采用三因素三水平正交试验，对pH、水分和时间等因素对毒素降解的效果进行测定，探索ZENC降解麸皮中玉米赤霉烯酮的应用方案。同时，在发酵麸皮生产中，也试验了ZENC与不同剂型发酵剂联用的效果，以期对发酵饲料的生产提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料 玉米赤霉烯酮降解酶ZENC来自青岛根源生物集团。麸皮购自市场，选取其中玉米赤霉烯酮含量较高者进行试验。玉米赤霉烯酮标准品购自ROMER Labs（奥地利)，常用试剂购自生工生物（上海）。

1.2 麸皮粉处理 用高速粉碎机（＞12000 r/min）将麸皮打成粉状，然后过2 mm筛。称取制好的麸皮粉500 g，分别装入自封袋中备用。

1.3 麸皮粉pH测定和调节 向10 g麸皮粉中加入50 mL蒸馏水，测得pH为4.23。分别向500 g麸皮粉中加入NaOH 5.6、6.0、6.3 g，调节pH至6.0、6.5、7.0。

1.4 饲料中玉米赤霉烯酮分析方法

1.4.1 玉米赤霉烯酮提取 参照GB 5009.209-2016食品中玉米赤霉烯酮测定中的采样方法，称取40 g待测样品（固体样品需粉碎，并过2 mm分样筛），向其中加入100 mL 80%乙腈水溶液（V/V）。混合液经高速匀质器（＞12000 r/min）处理1 min，使其充分混合。充分混合后用快速定性滤纸过滤，收集滤液。取10 mL滤液加入40 mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀释，再用玻璃纤维滤纸过滤，并收集滤液。

1.4.2 玉米赤霉烯酮净化 取上一步骤中滤液10 mL，使用玉米赤霉烯酮免疫亲和柱对其净化，试剂盒购自北京华安麦科生物技术有限公司。

1.4.3 玉米赤霉烯酮检测方法 使用高效液相色谱法检测净化后液体中玉米赤霉烯酮峰面积，根据玉米赤霉烯酮标准品峰面积计算其玉米赤霉烯酮含量。

色谱条件：C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm)，流动相：乙腈：甲醇：水=46：8：46（V/V/V)，流速：0.8 mL/min，荧光检测：激发和检测波长分别为274 nm和440 nm。

1.5 不同降解条件组合对玉米赤霉烯酮降解酶降解效果的影响 设计三因素三水平正交试验，分别是时间（4、8、24 h）、pH（6.0、6.5、7.0）、含水量（30%、40%、50%）。分别称取500 g麸皮粉装入自封袋中，加入所需量的NaOH溶液，将麸皮粉的pH调整到试验条件所需；加入ZENC，酶活单位为7000 U（1 U=1 min降解1μg玉米赤霉烯酮）；再加入适量的蒸馏水获得试验需要的含水量，揉捏自封袋以充分混匀。混匀后将自封袋放入30℃恒温培养箱中进行酶解，在降解4、8、24、48 h时分别取出125 g放入冰箱中，待48 h后将所有样品取出。然后将样品分别放入铝槽平铺开，放入80℃电热恒温鼓风干燥箱烘干。每种因素组合做三组平行试验。对照组中添加经高温灭活的降解酶，其余条件与试验组相同。

将烘干后的麸皮粉放入高速粉碎机（＞12000 r/min）粉碎成细末，提取其中的玉米赤霉烯酮检测其含量，数据使用SPSS 20.0分析统计。

1.6 ZENC在发酵麸皮中的应用 各组称取500 g麸皮，加入蒸馏水和发酵剂，使最终含水量均为42%，各组发酵剂配方如表1所示，充分混合后在35℃进行发酵，分别测定发酵0、8、48 h后玉米赤霉烯酮含量。

表1 发酵剂和毒素降解酶添加配方

2 结果与分析

2.1 玉米赤霉烯酮酶解条件的正交试验结果如表2所示，表2极差分析结果表明，当降解条件为pH 6.5、含水量50%、处理时间24 h时是最优条件，玉米赤霉烯酮降解酶对麸皮粉中的玉米赤霉烯酮降解效果最好。方差分析结果显示，处理时间F比＞F0.01＞pH，F比＞含水量F比＞F0.05＞F0.1，说明三种因素的水平改变对降解效果均有显著影响，其中处理时间的改变对玉米赤霉烯酮降解酶降解玉米赤霉烯酮的效果具有极显著的影响。

如图1所示，当试验条件为最优降解条件：pH 6.5、麸皮粉含水量50%、处理时间24 h时，降解后的麸皮粉中玉米赤霉烯酮含量为（203.45±6.25）μg/kg，远低于国家限定含量，玉米赤霉烯酮降解率为87.29%。

表2 三因素三水平正交试验结果

图1 最优条件下降解麸皮粉中玉米赤霉烯酮效果曲线图

2.2 ZENC在发酵麸皮中的应用结果 发酵前麸皮中玉米赤霉烯酮含量为1600μg/kg,降解后发酵麸皮中玉米赤霉烯酮含量如图2所示。

图2 玉米赤霉烯酮降解酶与乳酸杆菌复合使用对麸皮中玉米赤霉烯酮降解效果柱状图

发酵0 h时，复合使用试验组较对照组玉米赤霉烯酮含量低，说明在混合过程中，毒素的降解已经开始进行；发酵8 h后所有试验组中玉米赤霉烯酮含量均有下降，植物乳杆菌菌粉+酶组降解效果最好，其降解率可达51%，而乳酸菌发酵液+酶组降解率为18%；发酵48 h后玉米赤霉烯酮含量较发酵8 h略有下降，乳酸菌发酵液+酶组降解率仅为20.8%，植物乳杆菌菌粉+酶组降解率为53.4%。

ZENC酶学性质显示，其酶活pH为6.0～9.0，试验-1组（乳酸菌发酵液+酶）发酵0、8、48 h的样品pH分别为5.45、4.71、4.45，而试验-2组（植物乳杆菌菌粉+酶）在相应时间样品的pH分别为6.35、5.57、4.48，环境pH差异可能是导致毒素降解率不同的主要原因。在发酵麸皮的生产中，与乳酸菌菌粉联用，ZENC降解毒素的效果好于与乳酸菌发酵液联用。

3 讨论

按照国家GB 13078-2017《饲料卫生标准（新版）》对玉米赤霉烯酮允许量的规定，配合饲料和玉米及其加工产品中玉米赤霉烯酮的含量不得超过500μg/kg。我国对饲料原料中玉米赤霉烯酮的限量要求相较于对成品饲料中的含量要求较宽，对成品饲料中的玉米赤霉烯酮含量要求小于500μg/kg，其他猪配合饲料玉米赤霉烯酮含量小于250μg/kg。研究发现，我国饲料原料中的玉米赤霉烯酮检出率较高，超标率达10%（程传民等,2014)。利用降解途径明确的赤霉烯酮降解酶，优化对毒素的生物降解条件，有助于保证饲料品质的安全。

玉米赤霉烯酮生物降解法近几年来得到了较快发展，已有研究表明，多种微生物可以有效降解玉米赤霉烯酮。Fu等（2016）得到一株地衣芽孢杆菌CK1，在喂食给母猪后能够有效降低玉米赤霉烯酮对母猪产生的雌激素作用。Lei等（2014）筛选出1株枯草芽孢杆菌ANSB01G,在液体培养基中对ZEN降解率为88.65%,并且该菌能够降解自然霉变玉米，DDGS和猪配合饲料中的玉米赤霉烯酮。微生物的细胞壁对玉米赤霉烯酮也具有吸收作用（Keller等，2015），这解释了对照组虽然没有添加降解酶但其中的玉米赤霉烯酮含量仍然降低的现象。

目前，多种微生物来源的酯水解酶，对玉米赤霉烯酮的降解途径得到明确阐述，酶降解法可以直接作用于玉米赤霉烯酮分子本身，改变玉米赤霉烯酮的分子结构使其不再具有原有的生理毒性，同时，酶解处理毒素，对原料的营养构成影响小。发酵麸皮是一类新兴的发酵饲料，在发酵麸皮的生产中，添加适量毒素降解酶与发酵剂联用，不但可有效降解毒素，而且可降低生产成本。

4 结论

本研究采用酶降解法，通过设计三因素三水平正交试验获得了玉米赤霉烯酮降解酶最优降解条件，即当麸皮粉含水量为50%，pH为6.5，用玉米赤霉烯酮降解酶降解处理24 h时可以得到最优降解效果，玉米赤霉烯酮降解率达87.29%。在发酵麸皮的生产中，植物乳杆菌菌粉与ZENC联用，发酵48 h后，玉米赤霉烯酮降解率达到53.4%。本研究结果对麸皮等饲料原料的霉菌毒素降解提供一定依据，有助于提升饲料原料的品质。